نيو إنجلاند بيولابس، R3133M، SpeI-HF®

تمت إعادة صياغة SpeI-HF، وهي تشمل الآن أيضًا الألبومين المؤتلف (rAlbumin)، بدءًا من رقم الدفعة 10192521. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة S، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة المؤهلة لتوفير الوقت. التطبيقات: BioBrick®، التجميع، الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba-XbaI DNA في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف: محلول التخزين المخفف C: 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 250 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% بولوكسامر 188، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية ، تعطيل حراري عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة: س: كيف يمكنني البحث عن إنزيم تقييد باستخدام التسلسل أو الطرف البارز أو الاسم؟ ج: يمكن استخدام أداة البحث عن الإنزيمات، وهي أداة جديدة متوفرة على موقعنا الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة"، للبحث عن إنزيمات التقييد باستخدام الاسم أو التسلسل أو الطرف البارز أو النوع. تتضمن إنزيمات NEB أيقونات خصائص الإنزيم وتُعرض كرابط. س: كيف أوقف عملية هضم التقييد؟ ج: إذا لم تكن هناك أي عمليات أخرى مُخطط لها على الحمض النووي المهضوم، فيمكن إنهاء التفاعل بإضافة محلول إيقاف. في شركة NEB، نستخدم محلول الإيقاف التالي: 50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA (الأس الهيدروجيني 8.0)، و0.05% بروموفينول أزرق (10 ميكرولتر / 50 ميكرولتر حجم التفاعل). إذا لزم إجراء المزيد من التعديلات على الحمض النووي المهضوم، فإن التثبيط الحراري (رفع درجة الحرارة إلى 65 أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) هو أبسط طريقة لإيقاف التفاعل. ولأن هذه الطريقة لا تُجدي مع جميع إنزيمات القطع، يُرجى الرجوع إلى معلومات الكتالوج الخاصة بالإنزيمات المستخدمة. يُعد استخلاص الفينول/الكلوروفورم وسيلة أخرى لتثبيط إنزيم القطع. س: ما مدى استقرار إنزيم قطع معين؟ ج: تُفحص جميع الإنزيمات للتأكد من نشاطها كل 3-6 أشهر؛ ويُذكر تاريخ أحدث فحص على الملصق المرفق بكل قارورة من الإنزيم. بعد ثلاثين عامًا من الخبرة في مجال إنزيمات القطع، وجدنا أن معظمها يتمتع بثبات عالٍ عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول التخزين الموصى به. يجب تقليل التعرض لدرجات حرارة أعلى من -20 درجة مئوية قدر الإمكان. س: ما المقصود بـ HF® بعد اسم إنزيم القطع؟ ج: HF® اختصار لـ "الدقة العالية". تتميز العديد من إنزيمات القطع بقدرتها على قطع تسلسلات مشابهة، ولكنها ليست مطابقة تمامًا، لتسلسل التعرف المحدد لها. يُطلق على هذه الخصوصية المُعدلة أو المُخففة اسم "النشاط النجمي". تم تصميم إنزيمات القطع HF هندسيًا لقطع التسلسلات بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. تم استخدام فحوصات باستخدام تركيز متزايد من الجلسرين، وزيادة وقت التفاعل، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في نطاق واسع من الظروف. بالإضافة إلى ذلك، يتم تزويد جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرّف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة هنا. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المُرجّح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المُرجّح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى ظهور النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنّب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: كيف يُمكنني إعداد عملية هضم التقييد؟ ج: يتبع مُعظم الباحثين القاعدة العامة التي تنص على أن 10 وحدات من إنزيم التقييد الداخلي كافية للتغلب على التباين في مصدر الحمض النووي وكميته ونقائه. بشكل عام، يُضاف 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي المُنقّى في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر من محلول NEBuffer المناسب بتركيز 1X، ثم يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة الحرارة الموصى بها. في حال استخدام كمية زائدة من الإنزيم، يمكن تقليل مدة التحضين لتوفير الوقت. بدلاً من ذلك، يُمكنك هضم الحمض النووي بكفاءة باستخدام كمية أقل من الإنزيم لمدة تصل إلى 16 ساعة مع العديد من إنزيمات القطع. للحفاظ على تركيز الجلسرين أقل من 5% في التفاعل، يجب ألا تتجاوز كمية إنزيم القطع، المُزوّد ​​في محلول جلسرين بتركيز 50%، 10% من إجمالي حجم التفاعل. يُعدّ الخلط عنصرًا بالغ الأهمية، ولكنه غالبًا ما يُغفل عنه، لضمان نجاح عملية الهضم باستخدام إنزيمات القطع. يجب خلط المزيج جيدًا لإتمام عملية الهضم. نوصي بسحب المزيج برفق باستخدام ماصة أو بتحريك أنبوب التفاعل برفق. بعد ذلك، قم بتدوير المزيج بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير. تجنّب استخدام جهاز الخلط الدوّامي. س: لا أرى أي انقسام بعد عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. ما العوامل التي قد تعيق عملية الانقسام؟ ج: يجب أن يكون تحضير الحمض النووي المراد قطعه خاليًا من الملوثات مثل الفينول، والكلوروفورم، والكحول، وEDTA، والمنظفات، أو الأملاح الزائدة، حيث يمكن أن تعيق جميعها نشاط الإنزيمات القاطعة. يُعد مثيلة الحمض النووي أيضًا عنصرًا مهمًا في عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. إذا كنت تواجه صعوبة في قطع ركيزة الحمض النووي، فنوصي بإجراء تفاعلات التحكم التالية: حضن الحمض النووي التجريبي بدون إنزيم قاطع (يشير تحلل الحمض النووي إلى وجود تلوث في تحضير الحمض النووي أو محلول التفاعل) مع الحمض النووي الضابط (حمض نووي يحتوي على مواقع متعددة معروفة للإنزيم، مثل حمض نووي لامدا أو أدينوفيروس-2) مع الإنزيم القاطع لتقييم اكتمال التفاعل بدقة أكبر. إذا تم قطع الحمض النووي الضابط بينما قاوم الحمض النووي التجريبي القطع، فيمكن خلط الحمضين النوويين لتحديد ما إذا كان هناك مثبط موجود في العينة التجريبية. في حال وجود مثبط (غالباً ملح، أو EDTA، أو فينول)، لن يتم قطع الحمض النووي المرجعي بعد الخلط. س: كيف يمكنني إنشاء خريطة مواقع إنزيمات القطع لتسلسلي؟ ج: يتوفر برنامج NEBcutter®، وهو برنامج حاسوبي لرسم خرائط مواقع إنزيمات القطع، على موقع NEB الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة". يقبل البرنامج التسلسلات المسترجعة من ملف محلي أو من GenBank. كما يقبل تسلسلاً مُدخلاً يتم لصقه في حقل مُخصص. عند إدخال تسلسل، سيجد NEBcutter أكبر إطارات القراءة المفتوحة داخل التسلسل، ويُشير إلى إنزيمات القطع التي يُمكن استخدامها لاستئصال الجين. كما يُحدد مواقع جميع إنزيمات القطع التي تقطع مرة واحدة فقط داخل التسلسل المُختار. يُدرك NEBcutter أيضاً معلومات حساسية إنزيمات القطع للمثيلة، ويُنبه المستخدم إلى تداخل المثيلة بواسطة dam، وdcm، وما إلى ذلك. س: ما المعلومات المتوفرة في قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)؟ ج: قاعدة بيانات إنزيمات التقييد (REBASE)، الموجودة في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة" على موقعنا الإلكتروني، هي قاعدة بيانات شاملة تحتوي على معلومات حول إنزيمات التقييد والبروتينات ذات الصلة. تتضمن مراجع منشورة وغير منشورة، ومواقع التعرف والقطع، والمتماثلات، وتوافرها التجاري، وحساسيتها للمثيلة، وبيانات البلورات والتسلسل. كما تشمل أيضًا ناقلات مثيل الحمض النووي، والإنزيمات الداخلية الموجهة، وإنزيمات القطع، ووحدات التخصص، وبروتينات التحكم. ومؤخرًا، أُضيفت ناقلات مثيل الحمض النووي وإنزيمات التقييد المحتملة، كما تم التنبؤ بها من تحليل التسلسلات الجينومية. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (على سبيل المثال، يتعرف EcoRI على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج أو أكثر من القواعد غير المحددة بدقة (مثلًا، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على التسلسل RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: هل يُنصح بالهضم المطول (فترات حضانة تزيد عن ساعة واحدة)؟ ج: يعتمد تعريف وحدة إنزيمات التقييد لدينا على فترة حضانة مدتها ساعة واحدة. يمكن تقصير فترة الحضانة بإضافة وحدات إضافية من إنزيم التقييد إلى التفاعل. في المقابل، غالبًا ما تُستخدم فترات حضانة أطول للسماح للتفاعل بالاكتمال باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم. يعتمد هذا على المدة التي يمكن أن يبقى فيها إنزيم معين فعالًا (يحافظ على نشاطه) في التفاعل. بعض الإنزيمات تبقى حية لفترات طويلة (أكثر من 16 ساعة)، بينما لا يبقى البعض الآخر إلا ساعة واحدة أو أقل في التفاعل. لكل إنزيم تقييد، نُبلغ عن الحد الأدنى من الوحدات (1.0، 0.5، 0.25، أو 0.13) اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خلال 16 ساعة. يمكن استخدام الإنزيمات التي تتطلب أقل من وحدة واحدة بتراكيز أقل لفترات حضانة أطول. تجدر الإشارة إلى أن ركائز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تُهضم بمعدلات متفاوتة، وبالتالي يختلف عدد الوحدات اللازمة للهضم الكامل من ركيزة إلى أخرى. يُرجى مراجعة معلومات كل إنزيم تقييد على حدة قبل تمديد أوقات التفاعل، حيث يجب استخدام الإنزيمات ذات النشاط النجمي (star activity) وفقًا للشروط الموصى بها لمنع الانقسام غير التقليدي. سؤال: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المؤهلة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ جواب: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA). س: اختبرتُ إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من قِبل شركة NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بسبب وجود الملح في التفاعل. قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضافة إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك عن طريق تعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما معنى أن يكون المنتج مؤهلاً لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB المرفقة مع صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB مرفقة مع صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة صفحة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.