نيو إنجلاند بيولابس، R3136L، بامهاي-إتش إف®

تمت إعادة صياغة BamHI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10133983. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع B، إنزيمات القطع الموفرة للوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، 0.1 ملي مولار EDTA، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة . الأسئلة الشائعة : س: هل يوجد فرق في القطع بالقرب من الأطراف بين BamHI-HF وBamHI؟ ج: لا. عند اختبارهما على سلسلة من خمسة أوليغومرات (بطول 19-23 قاعدة) تحتوي على موقع التقييد وقاعدة A/T إضافية من 1 إلى 5 من النهاية، يقطع كلا الإنزيمين الأوليغومر على بعد زوج قاعدي واحد من النهاية. عند تصميم البادئات، توصي NEB بإضافة 6 قواعد إضافية لضمان عدم فشل التجربة بسبب اختلاف الركيزة وظروف التفاعل. س: هل يوجد أي فرق في حساسية المثيلة بين BamHI-HF وBamHI؟ ج: لا يُعد أي من BamHI-HF أو BamHI حساسًا لمثيلة dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على معلومات أكثر تحديدًا حول المثيلة، اتبع الرابط إلى قاعدة بيانات إنزيمات التقييد REBASE. س: ما الفرق بين BamHI-HF وBamHI؟ ج: يُنتَج BamHI-HF في بكتيريا الإشريكية القولونية من سلالة تحمل جين BamHI المستنسخ والمُعدَّل من بكتيريا Bacillus amyloliquefaciens H (ATCC 49763). س: كيف يُقارَن مستوى النشاط النجمي لـ BamHI-HF بـ BamHI؟ ج: حُدِّدَ مؤشر الدقة، الذي يقيس الحد الأدنى من الوحدات اللازمة لإنتاج النشاط النجمي، باستخدام الشروط التالية: محلول NEBuffer بتركيز 1X، و5% جلسرين، وحمض نووي لامدا (1 ميكروغرام/50 ميكرولتر)، وحُضِّنَ لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لعدد وحدات BamHI-HF المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي في محلول rCutSmart Buffer™ الموصى به هو (≥4000 وحدة). الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم BamHI اللازمة لإنتاج نشاط نجمي في محلول NEBuffer r3.1 الموصى به هو 32 وحدة. والحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم BamHI اللازمة لإنتاج نشاط نجمي في محلول rCutSmart Buffer هو 4 وحدات. س: لماذا تظهر حزم أكبر من المتوقع بعد الهضم باستخدام إنزيم BamHI-HF™؟ ج: زيادة التخصص لموقع القطع في إنزيم BamHI-HF™ أدت إلى زيادة ارتباط الإنزيم بالحمض النووي، وقد يبقى الإنزيم مرتبطًا بالحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي الهلامي. لتعطيل هذا الارتباط، أضف SDS بتركيز نهائي يتراوح بين 0.5% و1% أو قم بتنقية الحمض النووي قبل الفصل الكهربائي. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم القطع؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات القطع قادرة على قطع تسلسلات مشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها ولكنها ليست مطابقة له تمامًا. يُطلق على هذا التغير في التخصص أو انخفاضه اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، مما يقلل من نشاطها غير المرغوب فيه. استُخدمت تقنيات فحص تعتمد على زيادة تركيز الجلسرين، وزيادة زمن التفاعل، وزيادة تركيز الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في ظل ظروف متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: متى يُصبح النشاط غير المرغوب فيه مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط غير المرغوب فيه مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط غير المرغوب فيه. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات جلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط غير المرغوب فيه. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن يؤدي الهضم الليلي إلى ظهور نشاط غير مرغوب فيه. للحصول على نصائح حول تجنب هذا النشاط، يُرجى النقر هنا. س: لماذا يختلف المحلول المنظم الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن الإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة في جين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول المنظم. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI الأصلي محلول NEBuffer r3.1، وهو محلول منظم ذو قوة أيونية عالية. بينما يعمل إنزيم SalI-HF بكفاءة في محلولي NEBuffer r2.1 و rCutSmart Buffer™، وهما محلولان منظمان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة High Fidelity (HF®) من الإنزيم؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويجب اختيارها إذا كان النشاط غير المرغوب فيه مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص مثيلتها (نادرًا). تعرف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: كيف يتم قياس تحسن دقة إنزيمات التقييد HF؟ ج: يُقاس النشاط النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم التقييد من النوع البري مباشرةً مع النسخة المعدلة عالية الدقة. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط نجمي إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم تقييد معين. تُترجم قيمة مؤشر الدقة إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي. يمكن أن تتأثر قيمة مؤشر الدقة بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون. "يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا لنشاط النجوم لإنزيمات القطع المحددة للحمض النووي"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات القطع المحددة HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart المنظم الموصى به لإنزيمات HF لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB المنظمة. س: هل سيُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار النشاط النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEB المنظمة التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​النشاط النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الأصلي في جميع محاليل NEB المنظمة. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المُقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل نشاط الإنزيم النجمي إشكاليًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير مُوصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا بتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة بتقنية Time-Saver™ تهضم ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل المُوصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام الإنزيمات المؤهلة بتقنية Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني إجراء عملية هضم أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مُصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على ركيزة الحمض النووي المُوصى بها من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. قم بخلط محتويات القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لضمان تجانس المحلول. س: ما هي إنزيمات التقييد من شركة NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من شركة NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغ، الأرجواني (6X) س: هل يمكنك معرفة ذلك س: ما هي تفاصيل استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونُقدّم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن الأصباغ ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل باستخدام أصباغ SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الهلامات المُسبقة الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد ينتج تداخل الشرائط أو تلطيخها عن التحميل الزائد. عند استخدام صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأجاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأجاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل جل أجاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج رديئة. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المُذاب. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.