نيو إنجلاند بيولابس، R3138S، SalI-HF®

تمت إعادة صياغة SalI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10223617. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المحددة S، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. المواصفات: تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ (هضم HindIII) في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 10%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف A، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين، 300 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، الأس الهيدروجيني 7.5 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محجوبة. الأسئلة الشائعة : س: هل يوجد فرق في حساسية المثيلة بين SalI-HF و SalI؟ ج: يتأثر كل من SalI-HF و SalI بمثيلة CpG الجزئية المتداخلة في الثدييات، ويتم حجبهما بمثيلة أكثر شمولاً. لمزيد من المعلومات حول المثيلة، يُرجى مراجعة قاعدة بيانات إنزيمات التقييد REBASE. س: كيف يُقارن مستوى نشاط النجمة لـ SalI-HF بـ SalI؟ ج: تم تحديد مؤشر الدقة، الذي يقيس الحد الأدنى من الوحدات اللازمة لإنتاج نشاط النجمة، باستخدام الشروط التالية: محلول NEBuffer بتركيز 1X، جلسرين 5%، هضم الحمض النووي لامدا بواسطة HindIII (1 ميكروغرام/50 ميكرولتر)، حضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم SalI-HF اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول rCutSmart Buffer™ الموصى به هو 2000 وحدة أو أكثر. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم SalI اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول NEBuffer r3.1 الموصى به هو 4 وحدات. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم SalI اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول rCutSmart Buffer هو 0.03 وحدة. س: ما الفرق بين SalI-HF و SalI؟ ج: يُنتَج إنزيم SalI-HF في بكتيريا الإشريكية القولونية من سلالة تحمل جين SalI المستنسخ والمُعدَّل من بكتيريا Streptomyces albus G (ATCC 49789). س: لماذا يختلف المحلول الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن المحلول الموصى به للإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة في جين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI من النوع البري استخدام محلول NEBuffer r3.1، وهو محلول ذو قوة أيونية عالية. بينما يعمل إنزيم SalI-HF بكفاءة في محلولي NEBuffer r2.1 وrCutSmart Buffer™، وهما محلولان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم من النوع البري، ويُفضل اختيارها إذا كان النشاط الزائد مصدر قلق، أو إذا كان المحلول الموصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام نسخة HF. س: متى يُعد النشاط الزائد مصدر قلق؟ ج: يُعد النشاط الزائد مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُساهم تصميم التجربة في زيادة النشاط الزائد. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط الزائد. يُلاحظ تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. يزداد احتمال ظهور نشاط غير مرغوب فيه في عمليات الهضم التي تُجرى طوال الليل. للحصول على نصائح حول تجنب هذا النشاط، يُرجى النقر هنا. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة الإنزيم عالية الدقة (HF®)؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختيارها إذا كان النشاط غير المرغوب فيه مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص مثيلتها (نادرًا). تعرّف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: هل يُمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون للإنزيمات المعدلة (HF) محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart كمحلول منظم موصى به للإنزيمات المعدلة (HF) نظرًا لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB. س: هل يُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار النشاط النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​النشاط النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الأصلي في جميع محاليل NEBuffers. ومع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المقترح كلما أمكن ذلك، لأنه في بعض الحالات قد يظل النشاط النجمي إشكاليًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل منظمة غير موصى بها. س: كيف يتم قياس تحسن دقة إنزيمات القطع HF؟ ج: يُقاس النشاط النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم القطع الأصلي مباشرةً بنظيره المعدل HF. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط مميز إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم نوكلياز تقييدي معين. تُترجم قيمة FI إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج نشاط مميز. يمكن أن تتأثر قيمة FI بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون، "يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط المميز لإنزيمات نوكلياز التقييد DNA"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات نوكلياز التقييد قادرة على قطع تسلسلات مشابهة ولكنها ليست مطابقة لتسلسل التعرف المحدد لها. يُطلق على هذا التعديل أو التخفيف في الخصوصية اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع الداخلي عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. استُخدمت فحوصات باستخدام تركيز متزايد من الجلسرين، ووقت تفاعل أطول، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي تُوفر أعلى دقة في نطاق واسع من الظروف. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يُمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مُصممة ومُؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، البنفسجية 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما معنى أن يكون المنتج مؤهلاً لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري المصل (BSA) إلى الألبومين المؤتلف (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن الأصباغ ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل باستخدام أصباغ SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الهلامات المُسبقة الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد ينتج تداخل الشرائط أو تلطيخها عن التحميل الزائد. عند استخدام صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأجاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأجاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل جل أجاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج رديئة. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المُذاب. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.