نيو إنجلاند بيولابس، R3142S، KpnI-HF®

تمت إعادة صياغة KpnI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10133988. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة HM، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: هضم إنزيم القطع. تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba DNA في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 25%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف أ: محلول التخزين ، 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 50 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار داي ثيو ثريتول، 0.1 ملي مولار إيدتا، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: لماذا تظهر حزم أكبر من المتوقع بعد الهضم باستخدام إنزيم التقييد KpnI-HF؟ ج: زيادة الخصوصية لموقع القطع في KpnI-HF أدت إلى زيادة ارتباط الإنزيم بالحمض النووي، وقد يبقى الإنزيم مرتبطًا بالحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي الهلامي. لتعطيل هذا الارتباط، أضف SDS بتركيز نهائي يتراوح بين 0.5% و1% أو قم بتنقية الحمض النووي قبل الفصل الكهربائي. س: كيف تتم مقارنة مستوى النشاط النجمي لـ KpnI-HF مع KpnI؟ ج: تم تحديد مؤشر الدقة، الذي يقيس الحد الأدنى من الوحدات اللازمة لإنتاج النشاط النجمي، باستخدام الشروط التالية؛ محلول NEBuffer بتركيز 1X، و5% جلسرين، وحمض نووي لامدا (1 ميكروغرام/50 ميكرولتر)، يُحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لعدد وحدات KpnI-HF اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول rCutSmart Buffer™ الموصى به هو 250 وحدة أو أكثر. الحد الأدنى لعدد وحدات KpnI اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول NEBuffer r1.1 الموصى به هو 16 وحدة. الحد الأدنى لعدد وحدات KpnI اللازمة لإنتاج نشاط فائق في محلول rCutSmart Buffer هو 4 وحدات. س: ما الفرق بين KpnI-HF وKpnI؟ ج: تم تعديل KpnI-HF هندسيًا ليقطع بدقة أعلى مقارنةً بـ KpnI من النوع البري. تم تغيير تسلسل الأحماض الأمينية. س: هل يوجد أي فرق في حساسية المثيلة بين KpnI-HF وKpnI؟ ج: لا يُعدّ كلٌّ من KpnI-HF وKpnI حساسًا لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. لمزيد من المعلومات حول المثيلة، يُرجى زيارة قاعدة بيانات إنزيمات التقييد REBASE. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة الإنزيم عالية الدقة (HF®)؟ ج: تتمتع نسخة HF من الإنزيم بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختيارها إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص المثيلة (نادرًا). تعرّف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: كيف يتم قياس تحسين دقة إنزيمات التقييد الداخلية HF؟ ج: يُقاس النشاط النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة (FI) للإنزيم المقيد من النوع البري مباشرةً مع نظيره المُعدَّل (HF). س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط إضافي إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم مقيد معين. تُترجم قيمة مؤشر الدقة إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج نشاط إضافي. يمكن أن تتأثر قيمة مؤشر الدقة بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة: هوا وي وآخرون، "يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط الإضافي لإنزيمات التقييد DNA"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون للإنزيمات عالية الكفاءة (HF) محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الطبيعي؛ وهذا يُعدّ ميزة عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart Buffer كمحلول منظم مُوصى به لإنزيمات HF نظرًا لتوافقه العالي مع نظام محاليل NEB. س: هل يُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير المُوصى به؟ ج: تم اختبار النشاط النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​النشاط النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الطبيعي في جميع محاليل NEBuffers. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المُقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل النشاط النجمي مُشكلة في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير مُوصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم ركيزة وحدة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل المُوصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل يجب عليّ تحضير عملية الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ المعتمدة لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات التقييد النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات الملوحة العالية). قد تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح التي قد تنتقل إلى التفاعل وتثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رج القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات التقييد الداخلية قادرة على قطع التسلسلات المشابهة لتسلسل التعرف المحدد لها، ولكنها ليست مطابقة له تمامًا. يُطلق على هذا التغير في الخصوصية أو انخفاضها اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع HF لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. استُخدمت فحوصات باستخدام تركيزات متزايدة من الجلسرين، وزيادة وقت التفاعل، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي تُوفر أعلى دقة في نطاق واسع من الظروف. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية يُمكن أن يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. يُمكن أن يُعزز التصميم التجريبي النشاط النجمي. من المُرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يُلاحظ تركيز جلسرين بنسبة 5% عند تحضير تفاعل هضم مزدوج في حجم 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. يزداد احتمال ظهور نشاط غير مرغوب فيه عند الهضم طوال الليل. للحصول على نصائح حول تجنب هذا النشاط، يُرجى النقر هنا. س: لماذا يختلف المحلول المنظم الموصى به لنسخة HF من الإنزيم عن المحلول المنظم الموصى به للإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة في جين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول المنظم. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI الأصلي استخدام NEBuffer r3.1، وهو محلول منظم ذو قوة أيونية عالية. بينما يعمل إنزيم SalI-HF بكفاءة في NEBuffer r2.1 و rCutSmart Buffer™، وهما محلولان منظمان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: ما هي إنزيمات القطع NEB التي تُزود بصبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: يتم تزويد جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد NEB غير HF بصبغة تحميل الجل، أرجوانية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغ، الأرجواني (6X) س: هل يمكنك معرفة ذلك س: ما هي تفاصيل استبدال الألبومين البقري (BSA) بالألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ شركة NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1، وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1، وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونُقدّم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء عملية الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن الأصباغ ذات الألفة العالية لربط الأحماض النووية قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلامات بعد الفصل باستخدام أصباغ SYBR أو GelRed. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (داخل هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الهلامات المُسبقة الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد ينتج تداخل الشرائط أو تلطيخها عن التحميل الزائد. عند استخدام صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأجاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة أصباغ SYBR إلى الأجاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل جل أجاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج رديئة. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المُذاب. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.