نيو إنجلاند بيولابس، R3150S، PvuI-HF®

تمت إعادة صياغة PvuI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10128368. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة PR، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba DNA في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer ™: NEBuffer™ r1.1: 25%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل بالحرارة عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: محظورة. الأسئلة الشائعة: س: كيف يمكنني البحث عن إنزيم تقييد باستخدام التسلسل أو الطرف البارز أو الاسم؟ ج: يمكن استخدام أداة البحث عن الإنزيمات، وهي أداة جديدة متوفرة على موقعنا الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة"، للبحث عن إنزيمات التقييد باستخدام الاسم أو التسلسل أو الطرف البارز أو النوع. تتضمن إنزيمات NEB أيقونات لخصائص الإنزيم وتُعرض كرابط. س: كيف أوقف عملية هضم التقييد؟ ج: إذا لم تكن هناك أي عمليات أخرى مُخطط لها على الحمض النووي المهضوم، فيمكن إنهاء التفاعل بإضافة محلول إيقاف. في NEB، نستخدم محلول الإيقاف التالي: 50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA (الأس الهيدروجيني 8.0)، و0.05% أزرق بروموفينول (10 ميكرولتر / 50 ميكرولتر حجم التفاعل). إذا لزم إجراء المزيد من التعديلات على الحمض النووي المهضوم، فإن التثبيط الحراري (رفع درجة الحرارة إلى 65 أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) هو أبسط طريقة لإيقاف التفاعل. ولأن هذه الطريقة لا تُجدي مع جميع إنزيمات القطع، يُرجى الرجوع إلى معلومات الكتالوج الخاصة بالإنزيمات التي تستخدمها. يُعد استخلاص الفينول/الكلوروفورم وسيلة أخرى لتثبيط إنزيم القطع. س: ما مدى استقرار إنزيم قطع معين؟ ج: تُفحص جميع الإنزيمات للتأكد من نشاطها كل 3-6 أشهر؛ ويُذكر تاريخ أحدث فحص على الملصق المرفق بكل قارورة من الإنزيم. بعد ثلاثين عامًا من الخبرة في مجال إنزيمات القطع، وجدنا أن معظمها يتمتع بثبات عالٍ عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول التخزين الموصى به. يجب تقليل التعرض لدرجات حرارة أعلى من -20 درجة مئوية قدر الإمكان. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام إنزيم HF. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز 5% من الجلسرين عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: كيف يُمكنني إعداد عملية هضم التقييد؟ ج: يتبع معظم الباحثين القاعدة العامة التي تنص على أن 10 وحدات من إنزيم القطع المحدد كافية للتغلب على التباين في مصدر الحمض النووي وكميته ونقائه. عادةً، يُضاف 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي النقي في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر من محلول NEBuffer المناسب بتركيز 1X، ثم يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة الحرارة الموصى بها. في حال استخدام كمية زائدة من الإنزيم، يمكن غالبًا تقليل مدة التحضين لتوفير الوقت. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء عملية الهضم بكفاءة باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم لمدة تصل إلى 16 ساعة مع العديد من إنزيمات القطع. للحفاظ على تركيز الجلسرين أقل من 5% في التفاعل، يجب ألا تتجاوز كمية إنزيم القطع، المُقدم في محلول جلسرين بتركيز 50%، 10% من إجمالي حجم التفاعل. يُعد الخلط عنصرًا بالغ الأهمية، ولكنه غالبًا ما يُغفل عنه، في عملية الهضم الناجحة باستخدام إنزيمات القطع. يجب خلط مكونات التفاعل جيدًا لإتمام عملية الهضم. نوصي بسحب خليط التفاعل برفق باستخدام ماصة أو بتحريك أنبوب التفاعل برفق. ثم قم بتدويره سريعًا (باللمس) في جهاز طرد مركزي صغير. تجنب استخدام جهاز الخلط الدوامي. س: لا أرى أي انقسام بعد هضم الحمض النووي باستخدام إنزيمات القطع. ما العوامل التي قد تعيق عملية الانقسام؟ ج: يجب أن يكون تحضير الحمض النووي المراد قطعه خاليًا من الملوثات مثل الفينول، والكلوروفورم، والكحول، وEDTA، والمنظفات، أو الأملاح الزائدة، حيث يمكن أن تعيق جميعها نشاط إنزيمات القطع. يُعد مثيلة الحمض النووي أيضًا عنصرًا مهمًا في عملية الهضم باستخدام إنزيمات القطع. إذا كنت تواجه صعوبة في قطع ركيزة الحمض النووي، فنوصي بإجراء تفاعلات التحكم التالية: حضن الحمض النووي التجريبي بدون إنزيم القطع (يشير تحلل الحمض النووي إلى وجود تلوث في تحضير الحمض النووي أو محلول التفاعل) وحمض نووي تحكم (حمض نووي يحتوي على مواقع متعددة معروفة للإنزيم، مثل حمض نووي لامدا أو أدينوفيروس-2) مع إنزيم القطع لتقييم اكتمال التفاعل بدقة أكبر. إذا تم قطع الحمض النووي المرجعي، بينما قاوم الحمض النووي التجريبي القطع، فيمكن مزج الحمضين النوويين لتحديد ما إذا كان هناك مثبط موجود في العينة التجريبية. في حال وجود مثبط (غالبًا ما يكون ملحًا أو EDTA أو فينول)، فلن يتم قطع الحمض النووي المرجعي بعد المزج. س: كيف يمكنني إنشاء خريطة مواقع إنزيمات القطع لتسلسلي؟ ج: يتوفر برنامج NEBcutter®، وهو برنامج حاسوبي لرسم خرائط مواقع إنزيمات القطع، على موقع NEB الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة". يقبل البرنامج التسلسلات المسترجعة من ملف محلي أو من GenBank. كما يقبل أيضًا تسلسلًا مُدخلًا يتم لصقه في حقل مُخصص. عند إدخال تسلسل، سيجد NEBcutter أكبر إطارات القراءة المفتوحة داخل التسلسل، ويُشير إلى إنزيمات القطع التي يُمكن استخدامها لاستئصال الجين. كما يُحدد مواقع جميع إنزيمات القطع التي تقطع مرة واحدة فقط داخل التسلسل المُختار. يُدرك برنامج NEBcutter تمامًا المعلومات المتعلقة بحساسية إنزيمات القطع للمثيلة، وينبه المستخدم إلى تداخل المثيلة بواسطة إنزيمات مثل dam وdcm وغيرها. س: ما المعلومات المتوفرة في قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)؟ ج: قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)، الموجودة في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة" على موقعنا الإلكتروني، هي قاعدة بيانات شاملة تحتوي على معلومات حول إنزيمات القطع والبروتينات ذات الصلة. تتضمن مراجع منشورة وغير منشورة، ومواقع التعرف والقطع، والمتماثلات، والتوافر التجاري، وحساسية المثيلة، وبيانات البلورات والتسلسل. كما تشمل أيضًا ناقلات مثيل الحمض النووي، والإنزيمات الداخلية الموجهة، وإنزيمات القطع، ووحدات التخصص، وبروتينات التحكم. ومؤخرًا، أُضيفت ناقلات مثيل الحمض النووي وإنزيمات القطع المحتملة، كما تم التنبؤ بها من تحليل التسلسلات الجينومية. س: هل يُنصح بالهضم المطول (فترات حضانة تزيد عن ساعة واحدة)؟ ج: يعتمد تعريف وحدة إنزيمات القطع لدينا على فترة حضانة مدتها ساعة واحدة. يمكن تقصير فترة الحضانة بإضافة وحدات إضافية من إنزيم القطع إلى التفاعل. في المقابل، تُستخدم فترات حضانة أطول غالبًا للسماح للتفاعل بالاكتمال باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم. يعتمد هذا على مدة بقاء الإنزيم (الحفاظ على نشاطه) في التفاعل. بعض الإنزيمات تبقى حية لفترات طويلة (أكثر من 16 ساعة)، بينما يبقى البعض الآخر حيًا لمدة ساعة أو أقل فقط. لكل إنزيم قطع، نُبلغ عن الحد الأدنى لعدد الوحدات (1.0، 0.5، 0.25، أو 0.13) اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خلال 16 ساعة. يمكن استخدام الإنزيمات التي تتطلب أقل من وحدة واحدة بتراكيز أقل لفترات حضانة ممتدة. تجدر الإشارة إلى أن ركائز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تُهضم بمعدلات متفاوتة، وبالتالي فإن العدد الفعلي للوحدات اللازمة للهضم الكامل يختلف من ركيزة إلى أخرى. تحقق من معلومات كل إنزيم تقييد على حدة قبل تمديد أوقات التفاعل، حيث يجب استخدام الإنزيمات التي تُظهر نشاطًا غير نمطي في ظل الظروف الموصى بها لمنع الانقسام غير التقليدي. س: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ ج: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (مثلًا، EcoRI يتعرف على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج قاعدة واحد أو أكثر غير محدد بدقة (مثلًا، BsrFI-v2 يتعرف على RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث الانقسام. على سبيل المثال، يتعرف BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: HF® اختصار لـ "دقة عالية". تستطيع العديد من إنزيمات القطع المحددة قطع تسلسلات مشابهة، ولكنها ليست مطابقة تمامًا، لتسلسل التعرف المحدد لها. يُطلق على هذا التغير في الخصوصية أو انخفاضها اسم "النشاط النجمي". صُممت إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. استُخدمت فحوصات باستخدام تركيزات متزايدة من الجلسرين، وزيادة في وقت التفاعل، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي تُوفر أعلى دقة في نطاق واسع من الظروف. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرف على المزيد حول إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة هنا. سؤال: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يُمكنني الهضم لفترة أطول؟ جواب: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مُصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون تحلل الحمض النووي. س: هل يمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رج القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما معنى أن يكون المنتج مؤهلاً لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB المرفقة مع صبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB مرفقة مع صبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو DCM أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف في الحمض النووي الجينومي للثدييات التي تُحجب بمثيلة CpG. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.