نيو إنجلاند بيولابس، R3151S، PvuII-HF®

تمت إعادة صياغة PvuII-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10133992. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع المحددة PR، إنزيمات القطع المحددة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المحددة الموفرة للوقت. التطبيقات: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: <10%، NEBuffer™ r2.1: <10%، NEBuffer™ r3.1: <10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 200 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، لا حساسية للمثيلة، مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة . الأسئلة الشائعة : س: هل يوجد فرق في القطع بالقرب من الأطراف بين PvuII-HF وPvuII؟ ج: لا. عند اختبارهما على سلسلة من خمسة أوليغومرات (بطول 19-23 قاعدة) تحتوي على موقع التقييد وقاعدة A/T إضافية من 1 إلى 5 من النهاية، يقطع كلا الإنزيمين الأوليغومر على بعد زوج قاعدي واحد من النهاية. عند تصميم البادئات، توصي NEB بإضافة 6 قواعد إضافية لضمان عدم فشل التجربة بسبب اختلاف الركيزة وظروف التفاعل. س: هل يوجد أي فرق في حساسية المثيلة بين PvuII-HF وPvuII؟ ج: يتم حجب كل من PvuII وPvuII-HF بواسطة مثيلة EcoBI الكاملة. يتم حجب PvuII-HF بواسطة مثيلة EcoBI الجزئية بينما يكون PvuII معطلاً. للحصول على معلومات أكثر تحديدًا حول المثيلة، اتبع الرابط إلى قاعدة بيانات إنزيمات التقييد REBASE. س: كيف يُقارن مستوى النشاط النجمي لإنزيم PvuII-HF بإنزيم PvuII؟ ج: تم تحديد مؤشر الدقة، الذي يقيس الحد الأدنى من الوحدات اللازمة لإنتاج النشاط النجمي، باستخدام الشروط التالية: محلول NEBuffer بتركيز 1X، و5% جلسرين، وحمض نووي لامدا (1 ميكروغرام/50 ميكرولتر)، وحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم PvuII-HF المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي في محلول rCutSmart Buffer™ الموصى به هو 500 وحدة. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم PvuII المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي في محلول NEBuffer r2.1 الموصى به هو 16 وحدة. الحد الأدنى لعدد وحدات إنزيم PvuII المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي في محلول rCutSmart Buffer هو 0.25 وحدة. س: ما الفرق بين إنزيم PvuII-HF وإنزيم PvuII؟ ج: يُنتَج إنزيم PvuII-HF في بكتيريا الإشريكية القولونية من سلالة تحمل جين PvuII المُستنسخ والمُعدَّل من بكتيريا Proteus vulgaris (ATCC 13315). س: لماذا يختلف المحلول المُوصى به لإنزيم HF عن المحلول المُستخدم في الإنزيم الأصلي؟ ج: في كثير من الحالات، يؤدي تغيير الأحماض الأمينية المشحونة في جين إنزيم القطع إلى تغييرات في تفضيل المحلول. قد تكون هذه التغييرات كبيرة. على سبيل المثال، يتطلب إنزيم SalI الأصلي محلول NEBuffer r3.1، وهو محلول ذو قوة أيونية عالية. بينما يعمل إنزيم SalI-HF بكفاءة في محلولي NEBuffer r2.1 وrCutSmart Buffer™، وهما محلولان ذوا قوة أيونية متوسطة. س: متى يجب عليّ اختيار إنزيم HF؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام إنزيم HF. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز 5% من الجلسرين عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: متى يجب عليّ اختيار إنزيم High Fidelity (HF®)؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به، CutSmart®، أكثر ملاءمةً للهضم المزدوج أو أي بروتوكول آخر متعدد الخطوات. في بعض الحالات، قد تختلف إنزيمات HF في درجة حرارة (أو مدة) تعطيلها بالحرارة، وتحملها للملوحة، وخصائص مثيلتها (نادرًا). تعرف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart® المنظم الموصى به لإنزيمات HF لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB المنظمة. س: هل سيُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار نشاط الإنزيم النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEBuffers التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​نشاط الإنزيم النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الطبيعي في جميع محاليل NEBuffers. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل نشاط الإنزيم النجمي إشكاليًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير موصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا لتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة لتقنية Time-Saver™ تهضم وحدة ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: كيف يتم قياس تحسن دقة إنزيمات القطع HF؟ ج: يُقاس نشاط الإنزيم النجمي باستخدام مؤشر الدقة (FI). يمكن مقارنة مؤشر الدقة لإنزيم القطع الطبيعي مباشرةً بنظيره المُعدَّل من HF. س: ما هو مؤشر الدقة (FI)؟ ج: يُعرَّف مؤشر الدقة (FI) بأنه نسبة الحد الأقصى لكمية الإنزيم التي لا تُظهر أي نشاط نجمي إلى الحد الأدنى من الكمية اللازمة للهضم الكامل في موقع التعرف الخاص بأي إنزيم نوكلياز تقييدي معين. تُترجم قيمة FI إلى الحد الأدنى من الوحدات المطلوبة لإنتاج النشاط النجمي. يمكن أن تتأثر قيمة FI بالركيزة والمحلول المنظم والمواد المضافة مثل الجلسرين. يشرح المرجع التالي كيفية تحديد مؤشر الدقة. هوا وي وآخرون، "يوفر مؤشر الدقة قياسًا كميًا منهجيًا للنشاط النجمي لإنزيمات نوكلياز التقييد DNA"، مجلة أبحاث الأحماض النووية، 2008، المجلد 36، العدد 9: e50. س: ماذا يشير HF® بعد اسم إنزيم التقييد؟ ج: يشير HF® إلى الدقة العالية. العديد من إنزيمات نوكلياز التقييد قادرة على قطع تسلسلات مشابهة ولكنها ليست مطابقة لتسلسل التعرف المحدد لها. يُطلق على هذه الخصوصية المتغيرة أو المُخففة اسم النشاط النجمي. تم تصميم إنزيمات القطع عالية الدقة (HF) لتقطع بدقة أعلى من الإنزيم الطبيعي، مما يقلل من نشاطها غير المرغوب فيه. استُخدمت تقنيات فحص بتركيزات متزايدة من الجلسرين، ووقت تفاعل أطول، وتركيز عالٍ من الإنزيم لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في ظل ظروف متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، تُزود جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرّف على المزيد حول إنزيمات القطع عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عملية الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم القطع الخاص بكم على الحمض النووي الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبط الأملاح الموجودة في التفاعل إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي). قد تُؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي إلى محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الأملاح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبط نشاط الإنزيم. لتجنب ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. يُمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يُمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة صفحة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.