نيو إنجلاند بيولابس، R3658S، BmtI-HF®

تمت إعادة صياغة BmtI-HF باستخدام الألبومين المؤتلف (rAlbumin) بدءًا من رقم الدفعة 10161942. الفئات ذات الصلة: إنزيمات القطع عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع B، تطبيقات إنزيمات القطع المؤهلة لتوفير الوقت: الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB، مواصفات هضم إنزيم القطع : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من pXba في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 50%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 10%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 500 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل الإنزيم بالحرارة عند 25 درجة مئوية، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: كيف يمكنني البحث عن إنزيم تقييد باستخدام التسلسل أو الطرف البارز أو الاسم؟ ج: يمكنك استخدام أداة البحث عن الإنزيمات، وهي أداة جديدة متوفرة على موقعنا الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة"، للبحث عن إنزيمات التقييد باستخدام الاسم أو التسلسل أو الطرف البارز أو النوع. تتضمن إنزيمات NEB أيقونات لخصائص الإنزيم وتُعرض كرابط. س: كيف أوقف عملية هضم الحمض النووي بالتقييد؟ ج: إذا لم تكن هناك أي عمليات أخرى مُخطط لها على الحمض النووي المهضوم، فيمكن إنهاء التفاعل بإضافة محلول إيقاف. في NEB، نستخدم محلول الإيقاف التالي: 50% جلسرين، 50 ملي مولار EDTA (الأس الهيدروجيني 8.0)، و0.05% أزرق بروموفينول (10 ميكرولتر / 50 ميكرولتر حجم التفاعل). إذا لزم إجراء المزيد من التعديلات على الحمض النووي المهضوم، فإن التثبيط الحراري (رفع درجة الحرارة إلى 65 أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) هو أبسط طريقة لإيقاف التفاعل. ولأن هذه الطريقة لا تُجدي مع جميع إنزيمات القطع، يُرجى الرجوع إلى معلومات الكتالوج الخاصة بالإنزيمات التي تستخدمها. يُعد استخلاص الفينول/الكلوروفورم وسيلة أخرى لتثبيط إنزيم القطع. س: ما مدى استقرار إنزيم قطع معين؟ ج: تُفحص جميع الإنزيمات للتأكد من نشاطها كل 3-6 أشهر؛ ويُذكر تاريخ أحدث فحص على الملصق المرفق بكل قارورة من الإنزيم. بعد ثلاثين عامًا من الخبرة في مجال إنزيمات القطع، وجدنا أن معظمها يتمتع بثبات عالٍ عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية في محلول التخزين الموصى به. يجب تقليل التعرض لدرجات حرارة أعلى من -20 درجة مئوية قدر الإمكان. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام إنزيم HF. س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين تبلغ 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز 5% من الجلسرين عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: ما معنى أن تكون مؤهلاً لبرنامج Time-Saver™؟ ج: تقوم الإنزيمات المؤهلة لتوفير الوقت بهضم وحدة واحدة من ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل الموصى بها، ويمكن استخدامها بأمان أيضًا في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: كيف أقوم بإعداد عملية هضم باستخدام إنزيمات القطع؟ ج: يتبع معظم الباحثين القاعدة العامة التي تنص على أن 10 وحدات من إنزيمات القطع كافية للتغلب على التباين في مصدر الحمض النووي وكميته ونقائه. بشكل عام، يُضاف 1 ميكرولتر من الإنزيم إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي النقي في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر من محلول NEBuffer المناسب بتركيز 1X، ثم يُحضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة الحرارة الموصى بها. في حال استخدام كمية زائدة من الإنزيم، يمكن غالبًا تقليل مدة التحضين لتوفير الوقت. بدلاً من ذلك، يمكنك إجراء عملية الهضم بكفاءة باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم لمدة تصل إلى 16 ساعة مع العديد من إنزيمات القطع. للحفاظ على تركيز الجلسرين أقل من 5% في التفاعل، يجب ألا تتجاوز كمية إنزيم القطع، المُضاف في محلول جلسرين بنسبة 50%، 10% من إجمالي حجم التفاعل. يُعدّ الخلط عنصرًا بالغ الأهمية، ولكنه غالبًا ما يُغفل عنه، في عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة الناجحة. يجب خلط التفاعل جيدًا لإتمام عملية الهضم. نوصي بسحب خليط التفاعل برفق باستخدام ماصة أو بتحريك أنبوب التفاعل برفق. بعد ذلك، قم بتدوير سريع (باللمس) في جهاز طرد مركزي صغير. لا تقم بتقليب التفاعل باستخدام جهاز الخلط الدوامي. س: لا أرى أي قطع بعد عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. ما العوامل التي قد تؤثر على القطع؟ ج: يجب أن يكون تحضير الحمض النووي المراد قطعه خاليًا من الملوثات مثل الفينول، والكلوروفورم، والكحول، وEDTA، والمنظفات، أو الأملاح الزائدة، حيث يمكن أن تؤثر جميعها على نشاط إنزيم القطع. يُعدّ مثيلة الحمض النووي أيضًا عنصرًا مهمًا في عملية الهضم بالإنزيمات القاطعة. إذا واجهت صعوبة في قطع ركيزة الحمض النووي (DNA)، نوصي بإجراء تفاعلات التحكم التالية. حضّن الحمض النووي التجريبي بدون إنزيم القطع (يشير تحلل الحمض النووي إلى وجود تلوث في تحضير الحمض النووي أو محلول التفاعل) مع الحمض النووي الضابط (حمض نووي يحتوي على مواقع متعددة معروفة للإنزيم، مثل حمض نووي لامدا أو أدينوفيروس-2) مع إنزيم القطع، وذلك لتقييم اكتمال التفاعل بدقة أكبر. إذا تم قطع الحمض النووي الضابط بينما قاوم الحمض النووي التجريبي القطع، يمكن مزج الحمضين النوويين لتحديد ما إذا كان هناك مثبط موجود في العينة التجريبية. في حال وجود مثبط (غالبًا ما يكون ملحًا أو EDTA أو فينول)، فلن يتم قطع الحمض النووي الضابط بعد المزج. س: كيف يمكنني إنشاء خريطة مواقع إنزيم القطع لتسلسلي؟ ج: يتوفر برنامج NEBcutter®، وهو برنامج حاسوبي لرسم خرائط مواقع إنزيم القطع، على موقع NEB الإلكتروني في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة". يقبل البرنامج التسلسلات المسترجعة من ملف محلي أو من GenBank. يقبل البرنامج أيضًا تسلسلًا مُدخلًا يُلصق في حقل مُخصص. عند إدخال التسلسل، يحدد NEBcutter أكبر إطارات القراءة المفتوحة ضمنه، ويُشير إلى إنزيمات القطع التي يُمكن استخدامها لاستئصال الجين. كما يُحدد مواقع جميع إنزيمات القطع التي تقطع مرة واحدة فقط ضمن التسلسل المُختار. يُدرك NEBcutter أيضًا حساسية إنزيمات القطع للمثيلة، ويُنبه المستخدم إلى تداخل المثيلة بواسطة إنزيمات مثل dam وdcm وغيرها. س: هل يُنصح بإطالة فترة الهضم (أكثر من ساعة)؟ ج: يعتمد تعريف وحدة إنزيمات القطع لدينا على فترة حضانة مدتها ساعة واحدة. يُمكن تقصير فترة الحضانة بإضافة وحدات إضافية من إنزيم القطع إلى التفاعل. في المقابل، تُستخدم فترات حضانة أطول غالبًا للسماح للتفاعل بالاكتمال باستخدام عدد أقل من وحدات الإنزيم. يعتمد ذلك على مدة بقاء الإنزيم (الحفاظ على نشاطه) في التفاعل. بعض الإنزيمات تبقى فعّالة لفترات طويلة (أكثر من 16 ساعة)، بينما لا يبقى البعض الآخر إلا ساعة واحدة أو أقل في التفاعل. لكل إنزيم تقييد، نُحدد الحد الأدنى من الوحدات (1.0، 0.5، 0.25، أو 0.13) اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خلال 16 ساعة. يمكن استخدام الإنزيمات التي تتطلب أقل من وحدة واحدة بتراكيز أقل لفترات حضانة أطول. تجدر الإشارة إلى أن ركائز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) تُهضم بمعدلات متفاوتة، وبالتالي يختلف عدد الوحدات اللازمة للهضم الكامل من ركيزة إلى أخرى. يُرجى مراجعة معلومات كل إنزيم تقييد على حدة قبل تمديد فترات التفاعل، حيث يجب استخدام الإنزيمات التي تُظهر نشاطًا غير نمطي في ظل الظروف الموصى بها لمنع الانقسام غير التقليدي. سؤال: هل يجب أن تكون مواقع التعرف المتغيرة متناظرة؟ جواب: معظم مواقع التعرف لإنزيمات التقييد متناظرة وتتضمن أزواج قواعد محددة فقط (على سبيل المثال، يتعرف إنزيم EcoRI على GAATTC). مع ذلك، تحتوي بعض الإنزيمات على مواقع متغيرة، أي أنها تحتوي على زوج أو أكثر من القواعد غير المحددة بدقة (مثلًا، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على التسلسل RCCGGY، حيث R = A أو G و Y = C أو T). بالنسبة للإنزيمات المتغيرة، يمكن أن توجد أي قاعدة ممثلة بالرمز المكون من حرف واحد في أي من موقعي التعرف لحدوث القطع. على سبيل المثال، يتعرف إنزيم BsrFI-v2 على جميع التسلسلات التالية: ACCGGC، ACCGGT، GCCGGC، GCCGGT. س: ما المعلومات المتوفرة في قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)؟ ج: قاعدة بيانات إنزيمات القطع (REBASE)، الموجودة في الشريط الجانبي ضمن "الأدوات المفضلة" على موقعنا الإلكتروني، هي قاعدة بيانات شاملة تحتوي على معلومات حول إنزيمات القطع والبروتينات ذات الصلة. تحتوي على مراجع منشورة وغير منشورة، ومواقع التعرف والقطع، والمتماثلات، والتوافر التجاري، وحساسية المثيلة، وبيانات البلورات والتسلسل. تشمل هذه المجموعة أيضًا إنزيمات نقل ميثيل الحمض النووي، وإنزيمات النوكلياز الموجهة، وإنزيمات القطع، ووحدات التخصص، وبروتينات التحكم. ومؤخرًا، أُضيفت إنزيمات نقل ميثيل الحمض النووي وإنزيمات القطع المُحتملة، بناءً على التنبؤات المُستخلصة من تحليل التسلسلات الجينومية. س: ما المقصود بـ HF® بعد اسم إنزيم القطع؟ ج: HF® اختصار لـ "الدقة العالية". تتميز العديد من إنزيمات القطع بقدرتها على قطع تسلسلات مشابهة، ولكنها ليست مُطابقة تمامًا، لتسلسل التعرف المُحدد لها. يُطلق على هذا التخصص المُعدَّل أو المُخفَّف اسم "النشاط النجمي". صُممت إنزيمات القطع HF هندسيًا لقطع الحمض النووي بدقة أعلى من الإنزيم الأصلي، وبالتالي تُظهر نشاطًا نجميًا أقل. استُخدمت تقنيات فحص تعتمد على زيادة تركيز الجلسرين، وزيادة وقت التفاعل، وزيادة تركيز الإنزيم، لتحديد الإنزيمات التي توفر أعلى دقة في ظل ظروف متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، تُزوَّد جميع إنزيمات HF بمحلول rCutSmart Buffer™، بالإضافة إلى قارورة مجانية من صبغة التحميل البنفسجية. تعرّف على المزيد حول إنزيمات التقييد عالية الدقة هنا. س: هل يجب عليّ تحضير عمليات الهضم باستخدام إنزيمات Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني الهضم لفترة أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مصممة ومؤهلة لتحمّل عمليات الهضم طوال الليل دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرتُ إنزيم التقييد الخاص بكم على الحمض النووي الركيزة الموصى به من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: هل يمكن تخزين صبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين المُوصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو بتسخينها برفق لمدة 10 دقائق. قم بخلط محتويات القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لضمان تجانس المحلول. س: ما هي إنزيمات التقييد من شركة NEB التي تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من شركة NEB تأتي مع صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل صبغ، بنفسجي (6X) س: هل هذا هل هذا الإنزيم حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: لا. هذا الإنزيم غير حساس لـ dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة صفحة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من BSA إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على BSA (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل rAlbumin. نرى أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات SYBR كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم تركيز 0.5X فقط من صبغات SYBR في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغات أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. عند استخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الهلام وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المنصهر. يُفضل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60-125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأجاروز المنصهر. إضافة صبغة GelRed إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) تُحسّن النتائج. يُنصح دائمًا بتشغيل هلام أجاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® هي علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ هي علامة تجارية لشركة Biotium.