نيو إنجلاند بيولابس، R3712L، BspQI-HF®

تعرف على دقة الليغاز وتجاوز حدود الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع المقيدة عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع المقيدة B، تطبيقات إنزيمات القطع المقيدة المؤهلة لتوفير الوقت، حلول الاستنساخ عالية الإنتاجية والأتمتة، تجميع NEBridge® Golden Gate، الاستنساخ السريع: تسريع عمليات الاستنساخ الخاصة بك باستخدام الكواشف من NEB، تعريف وحدة المواصفات : تُعرف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لهضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي λ في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 10%، NEBuffer™ r2.1: 50%، NEBuffer™ r3.1: 25%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 10 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 100 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 7.4 عند 25 درجة مئوية. تعطيل حراري عند 25 درجة مئوية، ثم عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة، مثيلة dcm: غير حساسة، مثيلة CpG: غير حساسة. الأسئلة الشائعة : س: ما الفرق بين BspQI-HF وBspQI (R0712)؟ ج: BspQI-HF هو الإصدار عالي الدقة (HF) من BspQI (R0712). تم تصميم BspQI-HF واختياره لتقليل نشاطه الثانوي وتحقيق أداء عالٍ في محلول rCutSmart عند 37 درجة مئوية. يتمتع بنفس نشاط BspQI، وهو إنزيم نوكلياز داخلي من النوع IIS يتعرف على تسلسلات الحمض النووي غير المتماثلة ويقطعها خارج تسلسل التعرف. يتوفر BspQI بدرجة GMP. س: ما هي إنزيمات التقييد المستخدمة في تجميع Golden Gate؟ أ: تُعدّ تقنية التجميع الذهبي (Golden Gate Assembly) طريقة استنساخ فعّالة أحادية الأنبوب، تعتمد على إنزيمات التقييد من النوع IIS التي تقطع الحمض النووي خارج مواقع التعرف الخاصة بها، تاركةً نهايات بارزة بطول 3 أو 4 قواعد. يُعدّ إنزيم BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في هذه التقنية. كما تُقدّم شركة NEB نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميّز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهّلة لتوفير الوقت (حيث يُمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون إتلافه)، وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل ملحوظ. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في تقنية التجميع الذهبي: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف بطول 7 قواعد ونهايات بارزة بطول 3 قواعد). س: هل تُقدّم شركة NEB أي إنزيمات تقييد خالية من الألبومين البقري المصل (BSA) و/أو من أصل حيواني لتسلسل البلازميدات في تطوير لقاحات mRNA؟ ج: نعم، قامت NEB بتطوير بعض إنزيمات التقييد (بما في ذلك BspQI، وهو نظير SapI) بدون مكونات مشتقة من الحيوانات، ولا يظهر الألبومين البقري المصل في تركيبتها النهائية. بالإضافة إلى ذلك، لدينا العديد من إنزيمات التقييد المتاحة بدون الألبومين البقري المصل أو أي مكونات أخرى مشتقة من الحيوانات في تركيبتها النهائية. تشمل هذه القائمة: BbsI-HF، BsaI-HFv2، BspQI، وهو نظير LguI، متوفر الآن بدرجة GMP*، BspQI-HF، ClaI، HindIII-HF، PacI، SapI، SpeI، SwaI، XbaI، XhoI، XmnI. يمكن تطوير إنزيمات أخرى عند الطلب. يُرجى الاستفسار هنا. * "GMP Grade" و"GMP-grade" مصطلحات تجارية تستخدمها NEB لوصف المنتجات المصنعة أو المُنجزة في منشأة NEB في رولي. صُمم مصنع رولي لتصنيع المنتجات وفقًا لبنية تحتية وضوابط عمليات أكثر صرامة، وذلك لتحقيق مواصفات منتجات أكثر دقة وتلبية متطلبات العملاء. تُصنّع المنتجات في مصنع رولي التابع لشركة NEB وفقًا لمعايير نظام إدارة الجودة ISO 9001 وISO 13485. مع ذلك، لا تقوم NEB حاليًا بتصنيع أو بيع المنتجات المعروفة باسم المكونات الصيدلانية الفعالة (APIs)، كما أنها لا تُصنّع منتجاتها بما يتوافق مع جميع لوائح ممارسات التصنيع الجيدة الحالية. س: هل يمكنك إخباري المزيد عن التحول من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). نعمل حاليًا على تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. ونعتقد أن التخلي عن المنتجات الحيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونقدم هذه الميزة بنفس السعر. س: هل صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) الخالية من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة قد تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُنصح بشدة بتلوين الهلام بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). ولأن صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) تحتوي على تركيز أعلى من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، فقد يُلاحظ بعض التداخل عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي شركة NEB باستخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250-500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الجل المُسبق الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية من بروميد الإيثيديوم. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغة تحميل الجل البنفسجية (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم أصباغ SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المُصنّعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأغاروز المُذاب. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرّد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. يُرجى دائمًا تشغيل هلام أغاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلّل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الهلامات مُسبقة الصب. هذه الصبغة أكثر حساسية من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُشوّهة. يُفضّل الانتظار لبضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرّد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. يُرجى دائمًا تشغيل هلام أغاروز مُحضّر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج ضعيفة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.