مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية، R3733S، BsaI-HF®v2

يتوفر أيضًا كاشف من الدرجة GMP. الفئات ذات الصلة : إنزيمات القطع عالية الدقة (HF®)، إنزيمات القطع B، إنزيمات القطع المؤهلة لتوفير الوقت. التطبيقات: تجميع NEBridge® Golden Gate، هضم إنزيمات القطع، الاستنساخ السريع: سرّع عمليات الاستنساخ باستخدام كواشف من NEB. المواصفات : تعريف الوحدة : تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم اللازمة لهضم 1 ميكروغرام من حمض pXba DNA في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر. شروط التفاعل: محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، يُحضن عند 37 درجة مئوية. محلول rCutSmart™ بتركيز 1X، 50 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 20 ملي مولار أسيتات التريس، 10 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). النشاط في محاليل NEBuffer™: NEBuffer™ r1.1: 100%، NEBuffer™ r2.1: 100%، NEBuffer™ r3.1: 100%، محلول rCutSmart™: 100%. توافق المخفف : المخفف B، محلول التخزين : 20 ملي مولار تريس-هيدروكلوريد، 300 ملي مولار كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي مولار TCEP، 200 ميكروغرام/مل ألبومين مُعاد التركيب، 50% جلسرين، الأس الهيدروجيني 9 عند 25 درجة مئوية ، يُسخن. تعطيل عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حساسية المثيلة : مثيلة dam: غير حساسة. مثيلة dcm: تتأثر ببعض تركيبات تداخل مواقع CpG. مثيلة: تُحجب ببعض تركيبات تداخل مواقع CpG. الأسئلة الشائعة : س: متى يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق؟ ج: يُصبح النشاط النجمي مصدر قلق إذا كان ظهور نطاقات إضافية قد يُؤدي إلى سوء تفسير النتائج في إجراءات تحديد النمط الجيني وتحليل الطفرات. قد يُؤدي تصميم التجربة إلى زيادة النشاط النجمي. من المرجح أن تحتوي أحجام التفاعل الصغيرة على تركيزات من الجلسرين بنسبة 5% أو أكثر، وهي حالة معروفة بزيادة النشاط النجمي. يحدث تركيز جلسرين بنسبة 5% عند إجراء هضم مزدوج في تفاعل حجمه 20 ميكرولتر باستخدام 1 ميكرولتر من كل إنزيم. من المرجح أن تُؤدي عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة إلى توليد النشاط النجمي. للحصول على نصائح حول تجنب النشاط النجمي، يُرجى النقر هنا. س: متى يجب عليّ اختيار نسخة HF من الإنزيم؟ ج: يتمتع إنزيم HF بنفس خصوصية القطع التي يتمتع بها الإنزيم الأصلي، ويُنصح باختياره إذا كان النشاط النجمي مصدر قلق، أو إذا كان المحلول المنظم الموصى به أكثر ملاءمة للهضم المزدوج أو أي بروتوكول متعدد الخطوات. لا توجد أي عيوب لاستخدام إنزيم HF. س: هل يمكن أن يكون تغيير تفضيل المحلول المنظم لإنزيم HF مفيدًا؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF مزودة بمحلول rCutSmart® المنظم. عادةً ما يكون لإنزيمات HF محلول منظم مثالي مختلف عن الإنزيم الأصلي؛ وهذا قد يكون مفيدًا عند تصميم تجارب الهضم المزدوج. تم اختيار محلول rCutSmart المنظم كمحلول منظم موصى به لإنزيمات HF لأنه يُظهر أعلى مستوى من توافق الإنزيم مع نظام محاليل NEB المنظمة. س: هل سيُنتج إنزيم HF نشاطًا نجميًا مرتفعًا عند استخدامه في محلول منظم غير الموصى به؟ ج: تم اختبار النشاط النجمي على نطاق واسع في جميع محاليل NEB المنظمة التي أظهرت نشاطًا إنزيميًا بنسبة 50% على الأقل. ينخفض ​​النشاط النجمي بشكل ملحوظ مقارنةً بنشاط الإنزيم الأصلي في جميع محاليل NEB المنظمة. مع ذلك، نوصي باستخدام محلول التفاعل المُقترح كلما أمكن، لأنه في بعض الحالات قد يظل نشاط الإنزيم النجمي إشكاليًا في ظل ظروف قاسية عند استخدام محاليل غير مُوصى بها. س: ما معنى أن يكون الإنزيم مؤهلًا بتقنية Time-Saver™؟ ج: الإنزيمات المؤهلة بتقنية Time-Saver™ تهضم ركيزة الاختبار في غضون 5-15 دقيقة في ظل ظروف التفاعل المُوصى بها، ويمكن استخدامها بأمان في عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة. س: هل يجب عليّ إعداد عمليات الهضم باستخدام الإنزيمات المؤهلة بتقنية Time-Saver™ لمدة 5-15 دقيقة؟ هل يمكنني إجراء عملية هضم أطول؟ ج: تتميز إنزيمات Time-Saver™ من NEB بسرعة عملها (5-15 دقيقة)، كما أنها مُصممة ومؤهلة لتحمل عمليات الهضم التي تستغرق ليلة كاملة دون إتلاف الحمض النووي. س: اختبرت إنزيم التقييد الخاص بكم على ركيزة الحمض النووي المُوصى بها من NEB، ويبدو أنه نشط، ولكنه لا يهضم الحمض النووي الخاص بي. ما السبب المحتمل؟ ج: تُعد جودة ونقاء الحمض النووي من العوامل الرئيسية التي تؤثر على نشاط الإنزيم. قد تُثبَّط إنزيمات القطع النشطة في محلول rCutSmart®، ولكنها أقل نشاطًا في محلول NEBuffer r2.1 و/أو r3.1 (محاليلنا ذات التركيز الملحي العالي)، بفعل الملح في التفاعل. قد تُنتج إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم أعمدة الطرد المركزي محاليل حمض نووي ذات مستويات عالية من الملح، والتي قد تنتقل إلى التفاعل وتُثبِّط نشاط الإنزيم. ولمنع ذلك، نوصي بألا تتجاوز كمية محلول الحمض النووي المُضاف إلى التفاعل 25% من إجمالي حجم التفاعل. ويمكن تحقيق ذلك بتعديل إجمالي حجم التفاعل وفقًا لذلك. س: ما هي إنزيمات القطع المستخدمة في تقنية Golden Gate Assembly؟ ج: تقنية Golden Gate Assembly هي طريقة استنساخ فعالة أحادية الأنبوب تعتمد على إنزيمات القطع من النوع IIS التي تقطع خارج مواقع التعرف الخاصة بها، تاركةً نهايات بارزة بطول 3 أو 4 قواعد. يُعدّ إنزيم BsaI أكثر إنزيمات النوع IIS استخدامًا في تقنية Golden Gate Assembly. تقدم شركة NEB أيضًا نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة أو طوال الليل دون إتلافه) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا بشكل ملحوظ. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المُستخدمة في تجميع Golden Gate: BsmBI-v2/Esp3I، وBbsI/BbsI-HF، وPaqCI (نظير AarI مع تسلسل تعرف 7 أزواج قاعدية)، وSapI/BspQI/BspQI-HF (مع تسلسل تعرف 7 أزواج قاعدية وامتدادات 3 أزواج قاعدية). س: ما هي إنزيمات التقييد المُستخدمة في تجميع GoldenBraid؟ ج: BsaI هو أحد إنزيمات النوع IIS المُستخدمة في هذه الطريقة. تقدم شركة NEB أيضًا نسخة مُهندسة عالية الدقة من هذا الإنزيم، BsaI-HF®v2، والتي تتميز بميزة إضافية وهي كونها مُؤهلة لتوفير الوقت (حيث يمكنها هضم الحمض النووي في غضون 5-15 دقيقة ويمكن هضمها بأمان طوال الليل) وتُظهر نشاطًا نجميًا مُنخفضًا. يعمل BsaI-HFv2 في محلول CutSmart®، كما هو الحال مع إنزيم T4 DNA Ligase (وهو أيضًا جزء من سير عمل GoldenBraid) الذي يكون نشطًا وظيفيًا بنسبة 100% في هذا المحلول، عند إضافة 1 ملي مول من ATP إلى التفاعل. تشمل إنزيمات النوع IIS الأخرى المستخدمة في GoldenBraid كلاً من BsmBI-v2/Esp3I وBtgZI وBbsI/BbsI-HF وPaqCI (متماثل AarI مع تسلسل تعرف مكون من 7 أزواج قاعدية). المرجع: GoldenBraid 2.0: إطار عمل شامل لتجميع الحمض النووي في علم الأحياء التركيبي النباتي. سؤال: هل يمكن تخزين صبغة تحميل الجل، البنفسجي 6X (B7024) في درجات حرارة منخفضة؟ ج: درجة حرارة التخزين الموصى بها لصبغة تحميل الجل، بنفسجي 6X، هي درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). عادةً، قد يترسب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) من المحلول عند تخزين الصبغة في درجات حرارة منخفضة. يمكن التخلص من هذا الراسب الطفيف بترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو تسخينها برفق لمدة 10 دقائق. رجّ القارورة عدة مرات قبل الاستخدام لإعادة المحلول إلى تجانسه. س: كم عدد النيوكليوتيدات التي يجب إضافتها بجوار موقع التعرف على إنزيم التقييد للحصول على قطع فعال؟ ج: بروتوكول هضم إنزيم التقييد: القطع بالقرب من نهاية الحمض النووي. س: ما هي إنزيمات التقييد من NEB المرفقة مع صبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X)؟ ج: جميع إنزيمات التقييد HF ومعظم إنزيمات التقييد غير HF من NEB مرفقة مع صبغة تحميل الجل، بنفسجي (6X). الإنزيمات المقيدة غير HF التي تأتي مع الصبغة الأرجوانية هي: AatII AsiSI BsmBI-v2 EagI MboI NlaIII PvuI SmaI Acil AvrII BspHI EcoRI MboII NotI RsaI SpeI AfeI BamHI BsrGI EcoRV MluI NspI SacI StuI AflII BbsI ClaI Esp3I FseI MseI PacI SacII AgeI BglII DdeI HaeIII MspI PciI Sali XbaI AluI BsaI DpnI HindIII NcoI PmeI SapI XhoI ApaI BseYI DpnII HpaI NdeI PsiI-v2 SfaNI XmaI ApeKI BsiWI DraI KpnI NheI PstI SfiI XmnI AscI * يتم أيضًا توفير جميع إنزيمات تقييد HF مع تحميل الجل الصبغة الأرجوانية (6X) س: ما هو س: ما مدى فعالية إنزيم التقييد من النوع IIS، BsaI-HFv2 (NEB #R3733)، في محلول T4 DNA Ligase؟ ج: يُظهر BsaI-HFv2 فعالية كاملة (100%) في محلول T4 DNA Ligase. في المقابل، يُظهر BsaI (NEB #R0535) فعالية بنسبة 50% فقط في نفس المحلول. س: هل هذا الإنزيم حساس لـ Dam أو dcm أو مثيلة CpG في الثدييات؟ ج: نعم. لا يستطيع هذا الإنزيم قطع مواقع التعرف التي تتأثر ببعض تركيبات مثيلة dcm المتداخلة أو التي تُحجب ببعض تركيبات مثيلة CpG المتداخلة. للحصول على أحدث المعلومات حول حساسية المثيلة، يُرجى زيارة Dam-Dcm ومثيلة CpG أو REBASE. س: هل تُوفر NEB أي إنزيمات تقييد خالية من BSA و/أو خالية من أصل حيواني لتخطيط البلازميدات لتطوير لقاحات mRNA؟ ج: نعم، قامت شركة NEB بتطوير بعض إنزيمات التقييد (بما في ذلك BspQI، وهو نظير SapI) بدون مكونات مشتقة من الحيوانات، ولا يحتوي تركيبها النهائي على BSA. بالإضافة إلى ذلك، لدينا العديد من إنزيمات التقييد المتاحة بدون BSA أو أي مكونات أخرى مشتقة من الحيوانات في تركيبها النهائي. تشمل هذه القائمة: BbsI-HF، وBsaI-HFv2، وBspQI، وهو نظير LguI، ومتوفر الآن بدرجة GMP*، وBspQI-HF، وClaI، وHindIII-HF، وPacI، وSapI، وSpeI، وSwaI، وXbaI، وXhoI، وXmnI. يمكن تطوير إنزيمات أخرى حسب الطلب. يرجى الاستفسار هنا. * "GMP Grade" و"GMP-grade" مصطلحات تجارية تستخدمها NEB لوصف المنتجات المصنعة أو النهائية في منشأة Rowley التابعة لها. صُممت منشأة Rowley لتصنيع المنتجات وفقًا لبنية تحتية وضوابط عمليات أكثر صرامة لتحقيق مواصفات منتجات أكثر دقة وتلبية متطلبات العملاء. تُصنّع المنتجات في منشأة NEB في رولي وفقًا لمعايير نظام إدارة الجودة ISO 9001 وISO 13485. مع ذلك، لا تُصنّع NEB حاليًا أو تبيع منتجات تُعرف باسم المكونات الصيدلانية الفعالة (APIs)، كما أنها لا تُصنّع منتجاتها بما يتوافق مع جميع لوائح ممارسات التصنيع الجيدة الحالية. س: هل يُمكنكم إطلاعي على المزيد حول التحوّل من الألبومين البقري (BSA) إلى الألبومين المُعاد تركيبه (rAlbumin) في محاليل NEBuffers؟ ج: يسرّ NEB أن تُعلن عن استبدال محاليل التفاعل المحتوية على الألبومين البقري (NEBuffer 1.1، 2.1، 3.1 وCutSmart® Buffer) بمحاليل تحتوي على الألبومين المُعاد تركيبه (NEBuffer r1.1، r2.1، r3.1 وrCutSmart™ Buffer). كما أننا بصدد تحويل جميع تركيبات إنزيمات التقييد لتشمل الألبومين المُعاد تركيبه. نرى أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على مكونات حيوانية خطوة في الاتجاه الصحيح، ونستطيع تقديم هذا التحسين بنفس السعر. س: هل تكون بعض إنزيمات التقييد أكثر نشاطًا عند درجات حرارة حضانة أعلى من الموصى بها؟ ج: إنزيمات التقييد من NEB نشطة بنسبة 100% عند درجة حرارة الحضانة الموصى بها في المحلول المنظم الموصى به والمرفق مع كل إنزيم. مع بعض إنزيمات التقييد المعزولة من الكائنات المحبة للحرارة، قد تلاحظ زيادة في النشاط عند درجات حرارة حضانة أعلى. لا نوصي بزيادة درجة الحرارة، حيث قد تظهر أنشطة نوكلياز إضافية عند درجات حرارة غير موصى بها. س: هل صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X) أو صبغة تحميل الجل، بنفسجية (6X)، بدون SDS متوافقة مع أصباغ ربط الحمض النووي الأخرى مثل SYBR® وGelRed™ أثناء الفصل الكهربائي الهلامي؟ ج: نظرًا لأن أصباغ ربط الأحماض النووية عالية الألفة يمكن أن تؤثر على هجرة الحمض النووي أثناء الفصل الكهربائي، يُوصى بشدة بتلوين الهلامات بصبغات SYBR أو GelRed بعد الفصل الكهربائي. مع ذلك، يمكن استخدام هذه الأصباغ أيضًا كأصباغ مُسبقة الصب (في هلام الأغاروز). نظرًا لأن صبغة تحميل الهلام، البنفسجية (6X)، تحتوي على تركيز أعلى من SDS، فقد تُلاحظ بعض التداخلات عند استخدام SYBR أو GelRed كأصباغ مُسبقة الصب. عند استخدام هذه الأصباغ كأصباغ مُسبقة الصب، توصي NEB باستخدام صبغة تحميل الهلام، البنفسجية، الخالية من SDS (6X) (NEB #B7025S) بدلاً منها. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام أصباغ SYBR كأصباغ مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمّل إلى 250 إلى 500 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من أصباغ SYBR في الهلامات المُسبقة الصب. هذه الأصباغ أكثر حساسية بكثير من EtBr. قد يتسبب التحميل الزائد في ظهور حزم غير واضحة أو مُلطخة. في حال استخدام صبغة تحميل الجل، البنفسجي (6X) B7024S، استخدم محلول TBE بدلاً من محلول TAE، حيث يزداد تداخل SDS عند استخدام محلول TAE (في الجل وكسائل تشغيل). استخدم صبغات SYBR وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة: أضف صبغة SYBR إلى محلول TBE أولاً، ثم أضف مزيج صبغة SYBR/TBE إلى محلول الأجاروز المنصهر. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغات SYBR إلى الأجاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أجاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. قم دائمًا بتشغيل جل أجاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الجل ستؤدي إلى نتائج ضعيفة. يُرجى اتباع التوصيات التالية لكلا الصبغتين البنفسجيتين عند استخدام صبغات GelRed كصبغات مُسبقة الصب: قلل كمية الحمض النووي المُحمل إلى 60 إلى 125 نانوغرام، واستخدم 0.5X فقط من صبغة GelRed في الجلات مُسبقة الصب. هذا الصبغ أكثر حساسية بكثير من بروميد الإيثيديوم. قد يؤدي التحميل الزائد إلى ظهور أشرطة متوهجة أو متلطخة. يُفضل الانتظار بضع دقائق قبل إضافة صبغة GelRed إلى الأغاروز المنصهر. تُعطي إضافتها إلى محلول أغاروز مُبرد (أعلى من درجة حرارة التجلط، 45 درجة مئوية) نتائج أفضل. استخدم دائمًا هلام أغاروز مُحضر حديثًا، لمرة واحدة فقط. إعادة تشغيل الهلام ستؤدي إلى نتائج رديئة. SYBR® علامة تجارية مسجلة لشركة Life Technologies Corporation، وGelRed™ علامة تجارية لشركة Biotium.