نيو إنجلاند بيولابس، S1427L، أعمدة الدوران NEBExpress® Ni

الفئات ذات الصلة: تنقية الأميلوز (علامة MBP)، تنقية النيكل (علامة His)، تنقية التقارب، التطبيقات: علامة تقارب MBP، فصل البروتينات المدمجة، اختبارات السحب، المواصفات: محلول التخزين: 20% إيثانول، مادة الدعم : جزيئات دقيقة كروية الشكل مصنوعة من الأغاروز، يتراوح حجمها بين 10 و100 ميكرومتر. سعة الارتباط: تختلف باختلاف الهدف، ≥ 1 ملغ من البروتين المدمج الموسوم بعلامة His لكل عمود. الأسئلة الشائعة : س: ما كمية المستخلص التي يمكن تحميلها على عمود NEBExpress Ni Spin Column واحد؟ ج: يمكن لكل عمود استيعاب ما يصل إلى 500 ميكرولتر من المستخلص لكل تطبيق، ويوفر ما يقارب 1 ملغ من سعة الارتباط المتاحة. يمكن أن تختلف كفاءة الارتباط بشكل كبير بين الأهداف، وتعتمد على حجم البروتين وإمكانية الوصول إلى علامة His. من المهم تقدير مستوى التعبير عن البروتين المستهدف، ويمكن القيام بذلك عن طريق تشغيل كل من المستخلص ومعيار (بتركيز معروف) للقياس الكمي باستخدام SDS-PAGE. س: هل يؤدي تمديد فترة الارتباط إلى زيادة كمية البروتين في المستخلص باستخدام أعمدة NEBExpress® Ni Spin؟ ج: في بعض الحالات، قد يؤدي تمديد خطوة الارتباط إلى زيادة ملحوظة في ارتباط البروتين المستهدف. أغلق العمود بإحكام باستخدام السدادة المرفقة. اخلط المكونات رأسًا على عقب عند درجة حرارة 4 مئوية للمدة المطلوبة (عادةً من 5 إلى 15 دقيقة، ولكن يمكن تمديدها طوال الليل إذا لزم الأمر). مع ذلك، ضع في اعتبارك أن الخلط المطول قد يؤدي أيضًا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير النوعية. س: ما هو الحد الأدنى الموصى به لحجم التحميل؟ ج: الحد الأدنى الموصى به لحجم التحميل هو 50 ميكرولتر لكل عمود. س: هل من الضروري إغلاق العمود أثناء كل خطوة طرد مركزي؟ ج: لا، يمكن إجراء خطوات الطرد المركزي دون إغلاق العمود. يؤدي إغلاق العمود إلى تقليل معدل التدفق، وبالتالي تمديد وقت الارتباط. س: لماذا لا تتم إزالة السائل بالكامل أثناء عملية الطرد المركزي؟ ج: قد تختلف قوة الطرد المركزي بين أجهزة الطرد المركزي. من الممكن أيضًا أن يؤدي اختلاف لزوجة المحلول المُصفّى إلى انخفاض كفاءة التصفية أثناء الطرد المركزي. يمكن زيادة وقت الطرد المركزي إلى 2-5 دقائق عند الضرورة. س: لقد حضّرت محلولي بكمية كبيرة جدًا من المحلول المنظم، والهدف مخفف جدًا، هل يمكنني إضافة المزيد من المحلول بتكرار خطوات التحميل؟ ج: نعم، إذا كان حجم المحلول أكبر من 500 ميكرولتر، يمكن إجراء عدة تطبيقات على نفس العمود. يرتبط الارتباط الأمثل للهدف بالراتنج بتركيز الهدف، لذلك في بعض الحالات، حيث حدث تخفيف كبير، قد يكون من الضروري تحضير محلول أكثر تركيزًا لتحقيق الارتباط الأمثل لبروتين الهدف. س: كيف يمكنني تقليل البروتينات الملوثة في تنقية البروتين باستخدام عمود الطرد المركزي النيكل؟ ج: . أضف ما يصل إلى 10 ملي مول من الإيميدازول إلى محلول التحلل لمنع ارتباط الملوثات (يجب تحديد تركيزات الإيميدازول المثلى تجريبيًا). استخدم خطوات غسل إضافية (مثلًا، حتى 5 غسلات) باستخدام محلول الغسل الموصى به. زد تركيز الإيميدازول في محلول الغسل (اختبر ذلك بزيادة قدرها 5 ملي مول حتى 20 ملي مول)؛ قد تؤدي التركيزات العالية من الإيميدازول إلى انخفاض إجمالي إنتاج البروتين المستهدف. يعتمد التركيز الأمثل للإيميدازول على البروتين المستهدف/الشوائب، وبالتالي سيتطلب تحسينًا. س: ما هي التوصيات الخاصة بالاستخلاص القائم على الرقم الهيدروجيني، مقارنةً بالإيميدازول؟ ج: في كلتا الحالتين، سواءً باستخدام الإيميدازول أو التنقية القائمة على الرقم الهيدروجيني، يجب إجراء تحلل الخلايا في محلول منظم مضبوط على الرقم الهيدروجيني 7.4، مع إضافة كلوريد الصوديوم حتى 0.3 مول. بعد الارتباط، يُوصى باستخدام محلول غسل ذي رقم هيدروجيني يبلغ حوالي 6.3. يمكن إجراء عملية الإذابة باستخدام محلول منظم ذي درجة حموضة تتراوح بين 4.5 و 5.2. س: كيف يمكنني إزالة الإيميدازول من عينة بروتين؟ ج: لا يتداخل الإيميدازول عادةً مع التطبيقات اللاحقة، وبالتالي فإن إزالته اختيارية. قد يؤدي غلي عينة تحتوي على الإيميدازول قبل الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE إلى تحلل الروابط الحساسة للأحماض. يُنصح بدلاً من ذلك بحضانة العينة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في محلول تحميل SDS قبل التحليل. إذا لزم التخلص من الإيميدازول، فيمكن إزالته عن طريق الغسيل الكلوي، أو الترسيب بكبريتات الأمونيوم، أو الترشيح الفائق، أو باستخدام عمود إزالة الأملاح بالاستبعاد الحجمي. س: ما هي مزايا إجراء التنقية في ظروف مُفسِخة؟ ج: يعتمد قرار تنقية بروتين مُوسَم بالهيستيدين في ظروف مُفسِخة أو طبيعية على موقع البروتين وذوبانه، وإمكانية الوصول إلى وسم الهيستيدين، وما إذا كان يجب الاحتفاظ بالنشاط البيولوجي للتطبيقات اللاحقة أم لا. يُستخدم التنقية في ظروف مُفسِخة للبروتين عادةً عندما يحجب التركيب الثالثي للبروتين الأصلي علامة الهيستيدين، مما يجعل التنقية في الظروف الأصلية غير فعّالة، أو لإذابة الأجسام المُتضمنة. كما تُخفف الظروف المُفسِخة للبروتين من نشاط الإنزيمات المُحللة للبروتين، مما يُقلل من خطر تحلل البروتين المستهدف أثناء عملية التنقية. س: كيف يُمكنني تحديد ما إذا كان البروتين المستهدف لا يزال مُرتبطًا بالراتنج؟ ج: أضف 200 ميكرولتر من محلول تحميل SDS-PAGE إلى العمود، ثم اسحب وأعد سحب المحلول باستخدام الماصة، واسحب جزءًا من الراتنج من عمود الطرد المركزي. حضّن العينة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتحرير أي بروتين مُتبقٍ على الراتنج بعد الإذابة. حمّل البروتينات وحللها باستخدام SDS-PAGE. سيتم استخلاص مُعظم البروتينات بهذه الطريقة، بغض النظر عما إذا كانت مُرتبطة بالنيكل أو بخرزة الأغاروز نفسها. س: لماذا لا يُعد الإيميدازول ضروريًا في محلول التحلل/الربط؟ ولماذا يحتوي محلول الغسل على 5 ملي مولار فقط من الإيميدازول؟ تستخدم أعمدة NEBExpress™ Ni Spin راتنجًا انتقائيًا للغاية وخاصًا، على عكس راتنج Ni-NTA التقليدي، يتطلب كمية أقل من الإيميدازول في عملية التنقية. يتم تثبيت أيونات النيكل على سطح المادة الأساسية بواسطة رابطة خاصة تتميز بتجانسها وثباتها العاليين، وتوفر مقاومة ممتازة لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية، بما في ذلك هيدروكسيد الصوديوم، و EDTA، و DTT، و β-ME.