نيو إنجلاند بيولابس، S1428S، NEBExpress® Ni الراتنج

الفئات ذات الصلة: تنقية الأميلوز (علامة MBP)، نظام NEBExpress MBP للدمج والتنقية، التعبير البروتيني في بكتيريا الإشريكية القولونية، تطبيقات علامة تقارب MBP، انقسام البروتين المدمج، اختبارات السحب، المواصفات: محلول التخزين: 20% إيثانول، مادة الدعم: جزيئات دقيقة كروية الشكل مصنوعة من الأغاروز يتراوح حجمها بين 10 و100 ميكرومتر. سعة الارتباط: يرتبط 1 مل من راتنج NEBExpress™ Ni بما لا يقل عن 10 ملغ من البروتين المدمج الموسوم بالهيستيدين. الأسئلة الشائعة : س: هل يمكن استخدام راتنج NEBExpress® Ni في أنظمة التنقية واسعة النطاق والمضغوطة مثل FPLC؟ ج: نعم، يُعد راتنج NEBExpress® Ni خيارًا ممتازًا للتنقية واسعة النطاق في هذه الأنظمة الآلية. يُوصى باتباع الإرشادات التالية للاستخدام في نظام آلي مضغوط: يجب تعبئة الأعمدة بضغط ثابت يبلغ حوالي 1 بار (0.1 ميجا باسكال) أو بسرعة تدفق تعبئة تبلغ حوالي 400 سم/ساعة (ارتفاع طبقة 10 سم، 25 درجة مئوية، محلول منظم منخفض اللزوجة). أقصى ضغط يتحمله الراتنج هو 3 بار (0.3 ميجا باسكال). س: هل يحتاج راتنج NEBExpress Ni إلى التجديد بالنيكل بعد التنظيف؟ ج: لا، يتكون الراتنج من مصفوفة نيكل عالية الاستقرار تقلل من تسرب أيونات النيكل وتلغي الحاجة إلى تجديد النيكل حتى بعد دورات التنظيف في المكان (CIP) المتكررة. يُرجى الرجوع إلى بروتوكولات التفاعل النموذجية للاطلاع على إجراءات التنظيف في المكان الموصى بها. س: كيف يُمكنني تقليل البروتينات الملوثة في عملية تنقية البروتين عند استخدام راتنج النيكل؟ أ: أضف ما يصل إلى 10 ملي مول من الإيميدازول إلى محلول التحلل لمنع ارتباط الملوثات (يجب تحديد تركيزات الإيميدازول المثلى تجريبيًا). استخدم خطوات غسل إضافية (مثلًا، ما يصل إلى 5 أحجام إضافية من العمود) باستخدام محلول الغسل الموصى به. زد تركيز الإيميدازول في محلول الغسل (اختبر ذلك بزيادة قدرها 5 ملي مول حتى 20 ملي مول)؛ قد تؤدي التركيزات العالية من الإيميدازول إلى انخفاض إجمالي إنتاج البروتين المستهدف. يعتمد التركيز الأمثل للإيميدازول على البروتين المستهدف/الشوائب، وبالتالي سيتطلب تحسينًا. إذا كنت تشك في ارتباط الملوثات ببروتين الاندماج His-tag، فأضف 10 ملي مول من β-ميركابتوإيثانول أو 1 ملي مول من THP لتقليل روابط ثنائي الكبريتيد. زد تركيزات الملح و/أو المنظف أو أضف الإيثانول/الجلسرين إلى محلول الغسل لتعطيل التفاعلات غير النوعية. قد تنشأ الملوثات أيضًا على شكل أشكال مبتورة من بروتين الاندماج His-tag، لذا تحقق من احتمالية وجود بدايات ترجمة داخلية (His-tag في الطرف الكربوكسيلي) أو مواقع إنهاء مبكرة (His-tag في الطرف الأميني). تجنب تحلل البروتين أثناء التنقية عن طريق الحفاظ على برودة الراتنج (4 درجات مئوية) أو بإضافة مثبطات البروتياز. س: ما هي التوصيات الخاصة بالاستخلاص القائم على الرقم الهيدروجيني، مقارنةً بالإيميدازول؟ ج: في كلتا الحالتين، سواءً باستخدام الإيميدازول أو الرقم الهيدروجيني، يجب إجراء تحلل الخلايا في محلول منظم مضبوط على الرقم الهيدروجيني 7.4، مع إضافة كلوريد الصوديوم حتى 0.3 مولار. بعد الارتباط، يُوصى باستخدام محلول غسيل ذي رقم هيدروجيني يبلغ حوالي 6.3. يمكن إجراء الاستخلاص باستخدام محلول منظم ذي رقم هيدروجيني يتراوح بين 4.5 و5.2. س: كيف يمكنني إزالة الإيميدازول من عينة بروتين؟ ج: لا يتداخل الإيميدازول عادةً مع التطبيقات اللاحقة، وبالتالي فإن إزالته اختيارية. قد يؤدي غلي عينة تحتوي على الإيميدازول قبل الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE إلى تحلل الروابط الحساسة للأحماض. لذا، يُنصح بحضانة العينة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في محلول تحميل SDS قبل التحليل. في حال لزم التخلص من الإيميدازول، يمكن إزالته عن طريق الغسيل الكلوي، أو الترسيب بكبريتات الأمونيوم، أو الترشيح الفائق، أو باستخدام عمود فصل جزيئي لإزالة الأملاح. س: ما هي مزايا إجراء التنقية في ظروف مُفسِّخة؟ ج: يعتمد قرار تنقية بروتين مُوسَم بالهيستيدين في ظروف مُفسِّخة أو طبيعية على موقع البروتين وذوبانيته، وإمكانية الوصول إلى وسم الهيستيدين، وما إذا كان يجب الحفاظ على النشاط البيولوجي للتطبيقات اللاحقة. تُستخدم التنقية في ظروف مُفسِّخة في أغلب الأحيان عندما يحجب التركيب الثلاثي للبروتين الطبيعي وسم الهيستيدين، مما يجعل التنقية في الظروف الطبيعية غير فعالة، أو لإذابة الأجسام المُتضمنة. يمكن أن تُخفف ظروف التمسخ من نشاط الإنزيمات المحللة للبروتين، مما يقلل من خطر تحلل البروتين المستهدف أثناء عملية التنقية. س: كيف يمكنني تحديد ما إذا كان البروتين المستهدف لا يزال مرتبطًا بالراتنج؟ ج: أضف 200 ميكرولتر من محلول تحميل SDS-PAGE إلى العمود، ثم اسحب المحلول وأعده بالماصة، واسحب جزءًا من الراتنج من عمود الطرد المركزي. حضّنه عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتحرير أي بروتين متبقٍ على الراتنج بعد الإذابة. حمّل البروتينات وحللها باستخدام SDS-PAGE. سيتم استخلاص معظم البروتينات بهذه الطريقة، بغض النظر عما إذا كانت مرتبطة بالنيكل أو بخرزة الأغاروز نفسها. س: لماذا لا يُعد الإيميدازول ضروريًا في محلول التحلل/الربط؟ ولماذا يحتوي محلول الغسل على 5 ملي مولار فقط من الإيميدازول؟ ج: يستخدم راتنج NEBExpress Ni راتنجًا عالي الانتقائية وخاصًا يتطلب كمية أقل من الإيميدازول أثناء عملية التنقية مقارنةً براتنجات Ni NTA التقليدية. يعتمد التركيز الأمثل للإيميدازول على البروتين المستهدف والشوائب، وبالتالي يتطلب تحسينًا. س: لماذا يترسب البروتين على العمود؟ ج: من المحتمل أن البروتين يُشكّل تجمعات، أو أن درجة الحرارة منخفضة جدًا. يمكن تقليل الترسيب بإجراء عملية التنقية في درجة حرارة الغرفة، أو استخدام وضع الربط الدفعي لتقليل تركيز البروتين الموضعي العالي، و/أو إضافة عوامل إذابة إلى محاليل العمل (مثل 0.1% تريتون X-100 أو توين 20، أقل من 10 ملي مول من بيتا-ميركابتوإيثانول، حتى 2 مول من كلوريد الصوديوم أو عوامل مساعدة مثل أيونات المغنيسيوم). س: ما هو عمود الفصل بالجاذبية الذي توصون به؟ ​​ج: نوصي باستخدام عمود Econo Column من Bio-Rad بقطر داخلي 2.5 سم أو عمود Kontes Flex-Column. يمكن زيادة أو تقليل أحجام الأعمدة (القطر الداخلي والطول) بناءً على كمية الراتنج اللازمة لعزل البروتين المطلوب بكميات كافية. س: هل يؤدي تمديد فترة الارتباط إلى زيادة كمية البروتين المستخلص في الراشح باستخدام أعمدة NEBExpress® Ni Spin؟ ج: في بعض الحالات، قد يؤدي تمديد فترة الارتباط إلى زيادة ملحوظة في ارتباط البروتين المستهدف. أغلق العمود بإحكام باستخدام السدادة المرفقة. اخلط المكونات بتقليبها رأسًا على عقب عند درجة حرارة 4 مئوية للمدة المطلوبة (عادةً من 5 إلى 15 دقيقة، ولكن يمكن تمديدها طوال الليل إذا لزم الأمر). مع ذلك، ضع في اعتبارك أن الخلط المطول قد يؤدي أيضًا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير النوعية.