مجموعة تحضير البلازميد المصغرة من مونارك® سبين، نيو إنجلاند بيولابس، T1110L

الفئات ذات الصلة: تنقية البلازميد، تطبيقات تنقية الأحماض النووية، الأسئلة الشائعة حول تنقية الأحماض النووية. س: هل يمكنني شراء أعمدة وأنابيب تجميع Monarch بشكل منفصل؟ ج: نعم، تُباع الأعمدة وأنابيب التجميع (NEB #T1117) الخاصة بمجموعة Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit بشكل منفصل. س: هل يمكنني استخدام الماء لاستخلاص الحمض النووي عند استخدام مجموعة Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit؟ ج: نعم، يمكن استخدام الماء لاستخلاص الحمض النووي من أعمدة Monarch. وللحصول على أقصى كفاءة استخلاص، تأكد من خلو الماء من النيوكلياز وأن يكون الرقم الهيدروجيني بين 7 و8.5. غالبًا ما يكون ماء Milli-Q™ حمضيًا قليلاً، مما يتطلب تعديل الرقم الهيدروجيني. إذا كنت ستخزن الحمض النووي لفترة طويلة، فنوصي باستخدام محلول استخلاص الحمض النووي المرفق، والذي يحتوي على 0.1 ملي مول من EDTA ويمكن أن يساعد في تثبيط النيوكليازات المعتمدة على المعادن. س: بالنسبة لمجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)، ما هي أوساط الاستنبات التي توصون بها لزراعة بكتيريا الإشريكية القولونية؟ ج: نقترح استخدام وسط LB (لوريا-بيرتاني) لزراعة الإشريكية القولونية. يمكن أيضًا استخدام أوساط غنية مثل 2X YT أو مرق تيريفيك، ولكنها عادةً ما تؤدي إلى كثافة خلوية أعلى بكثير عند التشبع. لذلك، من الضروري تقليل كمية المزرعة المعالجة باستخدام الأوساط الغنية لتجنب عدم كفاية التحلل القلوي وتحميل العمود الزائد بسبب زيادة الكتلة الحيوية. س: ما هي سلالات الإشريكية القولونية الموصى باستخدامها مع مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: يمكن استخدام معظم سلالات الاستنساخ المختبرية القياسية كمضيفات لتكاثر البلازميدات من أجل تنقية miniprep. تشمل السلالات المناسبة المتوفرة من NEB ما يلي: NEB 10-beta (NEB #C3019)، وNEB 5-alpha (NEB #C2987)، وNEB Turbo (NEB #C2984)، وNEB Stable (NEB #C3040). قد يكون من المفيد تجنب سلالات مثل HB101 أو سلسلة JM100، لاحتوائها على كميات كبيرة من الكربوهيدرات التي قد تتداخل مع الخطوات الإنزيمية اللاحقة. س: ما هي ظروف الاستزراع التي توصون بها للحصول على أفضل أداء مع مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: يجب تلقيح المزارع من مستعمرة واحدة وتنميتها في وجود مضاد حيوي مناسب طوال مدة الاستزراع. يمكن إجراء الاستزراع الفرعي من مزارع بادئة، ولكن قد تختلف النتائج. يجب حصاد الخلايا عند انتقال المزرعة من الطور اللوغاريتمي إلى الطور الثابت لضمان وجود أكبر كمية من الحمض النووي البلازميدي مع حدوث أقل قدر من تحلل الخلايا. في عمليات الاستنساخ الروتينية باستخدام بلازميدات متوسطة إلى عالية النسخ، يمكن استخدام مستعمرة واحدة لتلقيح مزرعة بحجم 5-10 مل تُنمى عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة. معالجة 1-3 مل من هذه المزرعة ينتج عنها 3-6 ميكروغرام من بلازميد عالي النسخ أو 1-2 ميكروغرام من بلازميد متوسط ​​النسخ. أما البلازميدات منخفضة النسخ فستنتج كميات أقل، ويمكن معالجة ذلك بمعالجة أحجام أكبر من المزرعة مع زيادة حجم محاليل التخزين المؤقت B1-B3 أو بتركيز الحمض النووي المنقى. س: كيف يمكنني منع تلوث الحمض النووي بالحمض النووي الريبوزي (RNA) عند استخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: لتجنب تلوث الحمض النووي بالحمض النووي الريبوزي (RNA) عند استخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit الجديدة (NEB #T1110)، من المهم استخدام إنزيم RNase A وفقًا للتعليمات الواردة في البروتوكول. يجب إضافة إنزيم RNase A إلى محلول التخزين المؤقت B1 من Monarch (محلول إعادة التعليق، وردي اللون) مع التأكد من التركيز الصحيح. يُحفظ المحلول المنظم عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد إضافة إنزيم RNase A. أثناء عملية تنقية البلازميد، عند إضافة المحلول المنظم B3 (محلول التعادل، أصفر اللون)، تأكد من خلط العينة جيدًا واتركها تُحضن للمدة الموصى بها للسماح بتحلل الحمض النووي الريبي (RNA). بالنسبة لأحجام مزارع البكتيريا التي تتجاوز 3 مل، زد وقت الطرد المركزي بعد إضافة محلول التعادل إلى 5 دقائق لإتاحة وقت أطول لإنزيم RNase لهضم الحمض النووي الريبي. س: ما هو أصغر حجم من محلول الإذابة الذي يمكن استخدامه مع مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: تم تحسين البروتوكول لتوفير غلة جيدة باستخدام حجم إذابة منخفض يصل إلى 30 ميكرولتر من محلول الإذابة. يمكن استخدام كميات أقل لزيادة التركيز، ولكن ستنخفض الغلة الإجمالية بسبب عدم ترطيب الغشاء بشكل كامل. يمكن أيضًا استخدام أحجام إذابة أكبر، ولكن سيكون تركيز الحمض النووي المُذاب أقل. س: ما هو تركيب كل محلول منظم متوفر مع مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: تركيب المحاليل المنظمة هو ملكية خاصة. ومع ذلك، يمكننا مشاركة ما يلي: محلول مونارك B1 (محلول إعادة التعليق): محلول إعادة تعليق قائم على Tris، محلول مونارك B2 (محلول التحلل): محلول تحلل قائم على هيدروكسيد الصوديوم وSDS، محلول مونارك B3 (محلول التعادل): محلول تعادل قائم على هيدروكلوريد الغوانيدين، محلول مونارك BZ (محلول الغسل 1): محلول غسل قائم على الغوانيدين/الأيزوبروبانول، محلول مونارك WZ (محلول الغسل 2): محلول غسل قائم على الإيثانول، محلول مونارك EY (محلول الإذابة): محلول إذابة 10 ملي مولار Tris، 0.1 ملي مولار EDTA، درجة حموضة 8.5. س: عند استخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)، لماذا قد ألاحظ لطخة فوق شريط البلازميد على هلام الأغاروز؟ ج: قد يشير وجود لطخة عند وزن جزيئي أعلى من حزمة البلازميد إلى تلوث تحضير البلازميد بالحمض النووي الجينومي. على الرغم من أن هذا غير شائع، إلا أن الحمض النووي الجينومي قد يتعرض للتقطيع أثناء التحلل ويُنقى مع البلازميد. من المرجح أن يؤدي الرج أو الخلط الشديد بعد إضافة المحلول B2 إلى إنتاج حمض نووي جينومي مقطع، لذا يجب تجنبه. إذا كان المحلول شديد اللزوجة ولا يمتزج جيدًا، فابدأ بعدد أقل من الخلايا لتحضير البلازميد المصغر. س: عند استخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)، ما الذي يفسر ظهور حزم إضافية على الهلام؟ ج: يجب أن يكون الشكل السائد للحمض النووي الناتج هو الشكل الحلزوني الفائق، والذي يتميز عادةً بسرعة حركة أكبر أثناء الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز مقارنةً بالبلازميد الخطي. بالإضافة إلى هذين الشكلين، قد تلاحظ أيضًا: شكلًا مفتوحًا أحادي السلسلة بأوزان جزيئية أقل من الشكل الحلزوني الفائق. يعود ذلك إلى التحلل القلوي المفرط، مما يؤدي إلى تمسخ البلازميد. يظهر شكل مفتوح أو مُرخى، يُشار إليه بالشكل الدائري المفتوح، وعادةً ما يهاجر إلى ارتفاع أعلى من الشكل الخطي. كما تظهر مُتعددات البلازميد أو مُتعددات البلازميد بأوزان جزيئية أعلى. قد تختلف المواضع النسبية لهذه الحزم في محاليل TAE مقارنةً بمحاليل TBE. س: ما العوامل التي تؤثر على استخلاص الحمض النووي البلازميدي عند استخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: هناك عوامل تؤثر على استخلاص البلازميد، سواءً قبل التحضير أو أثناءه. يمكن أن يؤثر عدد نسخ البلازميد، وحجمه، وسمية الجزء المُدخل، وسلالة الخلية المضيفة، واختيار المضادات الحيوية، ووسط النمو، وظروف الاستزراع، جميعها على استخلاص البلازميد في المراحل اللاحقة. خصائص البلازميد: يؤثر عدد نسخ البلازميد وحجمه وسمية الجزء المُدخل بشكل مباشر على كمية البلازميد الموجودة في كل خلية. للحصول على إنتاجية أعلى، اختر بلازميدات ذات عدد نسخ عالٍ عند الاقتضاء، خاصةً للبلازميدات التي يبلغ حجمها 10 كيلوبايت أو أقل. يمكن عزل البلازميدات الأكبر حجمًا، حتى 25 كيلوبايت، ولكن ستكون الكمية أقل. سلالة العائل وظروف الاستزراع: يُعد اختيار سلالة العائل، ونوع المضاد الحيوي، ووسط النمو، وظروف الاستزراع أمورًا بالغة الأهمية. يضمن الحفاظ على استخدام المضاد الحيوي أثناء النمو عدم فقدان البلازميد، ويمنع سيطرة مجموعة من الخلايا الأسرع نموًا التي لا تحمل البلازميد على المزرعة. كما يضمن التهوية المناسبة ودرجة حرارة النمو نمو الخلايا نموًا لوغاريتميًا مع تحلل خلوي ضئيل. إجراء التحضير: يُعد استخدام الكمية المناسبة من الخلايا واتباع البروتوكول أمرًا أساسيًا. غالبًا ما يؤدي الخروج عن الإرشادات بهدف "زيادة الكمية" إلى انخفاض الكمية وجودة الحمض النووي. تأكد من إعادة تعليق الراسب البكتيري بالكامل (بدون تكتلات مرئية) قبل إضافة محلول مونارك B2 للتحلل القلوي، الذي يُسبب تمسخ كل من الحمض النووي الصبغي والبلازميدي. المعادلة: تأكد من اكتمال المعادلة بعد إضافة محلول مونارك B3، ومن إعادة تكوين الحمض النووي البلازميدي، وذلك بالتحقق من أن المحلول أصفر تمامًا قبل الطرد المركزي. قد يؤدي عدم اكتمال عملية التحييد إلى عدم ترسب حطام الخلايا (البروتين/ الحمض النووي الصبغي/ غشاء الخلية) في قاع الأنبوب، مما يُصعّب استخلاص السائل الطافي. لذا، يُرجى توخي الحذر لتجنب نقل حطام الخلايا الذي قد يسد عمود مونارك. س: ما العوامل التي تؤثر على نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر بعد إجراء تحضير مصغر للبلازميد باستخدام مجموعة مونارك® سبين لتحضير البلازميد المصغر (NEB #T1110)؟ ج: أثناء تحضير البلازميد المصغر، تُشير نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر إلى النقاء النسبي للحمض النووي المستخلص، وذلك بمقارنة الامتصاص عند 260 نانومتر، حيث يكون امتصاص الأحماض النووية في أعلى مستوياته، بالامتصاص عند 280 نانومتر، حيث يكون امتصاص البروتينات في أعلى مستوياته. قد يسمح عدم كفاءة التحييد أو عدم كفاية الغسل ببقاء البروتين الزائد مرتبطًا بالمصفوفة وخروجه مع الحمض النووي. استخدام محلول الاستخلاص المرفق لاستخلاص العينة ومعايرة جهاز قياس الطيف الضوئي يضمن عدم حدوث أي تغيير في نسبة الامتصاص عند 260/280 نانومتر بسبب حموضة العينة. إذا استُخدم الماء لاستخلاص الحمض النووي، فاستخدم نفس الماء كعينة مرجعية في جهاز قياس الطيف الضوئي. س: ما العوامل التي تؤثر على نسبة الامتصاص عند 260/230 نانومتر بعد إجراء تحضير مصغر للبلازميد باستخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)؟ ج: قد تُقلل مكونات الوسط وبعض المكونات الخلوية من نسبة الامتصاص عند 260/230 نانومتر. سيضمن اتباع البروتوكول إزالة هذه الملوثات. بالإضافة إلى ذلك، قد تخرج بعض الجسيمات مع الحمض النووي، مما يؤثر على النسبة. في هذه الحالة، يُنصح بإجراء عملية تدوير إضافية لمدة 15 ثانية للحمض النووي المستخلص لترسيب الجسيمات قبل التقييم باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي (Nanodrop®). كما يُساعد سحب عينة الحمض النووي من أعلى العينة على تجنب نقل أي جسيمات. س: ما هي السعة القصوى لربط عمود Monarch Plasmid Miniprep؟ ج: تكفي المادة المرفقة في كل عمود لربط 20 ميكروغرامًا من الحمض النووي النقي في ظل ظروف الاختبار. يؤدي إجراء عملية تحضير مصغرة إلى إدخال مكونات خلوية مثل الكربوهيدرات والبروتينات والأحماض النووية المتبقية من الخلية المضيفة؛ وكلها قد تتنافس على الارتباط بالمصفوفة وتؤثر على استخلاص الحمض النووي البلازميدي. س: ما الذي يجب عليّ فعله بشكل مختلف عند استخدام بلازميد منخفض النسخ؟ ج: يكون استخلاص البلازميدات منخفضة النسخ أقل دائمًا مقارنةً بالبلازميدات عالية النسخ. إن ضمان نمو المزرعة مع التهوية المناسبة وحصادها قبل حدوث تحلل خلوي كبير سيزيد من عدد الخلايا السليمة الحاملة للبلازميد. يمكن أن يؤدي استخدام المزيد من الخلايا إلى تعويض بعض النقص، ولكن يجب الالتزام بالإرشادات المرفقة لضمان كفاءة التحلل القلوي وعدم تحميل العمود بشكل زائد بالمكونات الخلوية. يرجى أيضًا مراجعة إرشاداتنا للعمل مع البلازميدات منخفضة النسخ ومذكرة التطبيق الخاصة بنا حول إزالة الحمض النووي الجينومي عند العمل مع البلازميدات منخفضة النسخ. س: هل تؤثر الأصباغ الموجودة في محلول منظم مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110) على تطبيقات الحمض النووي اللاحقة؟ ج: لا، لقد تم اختبار الحمض النووي المنقى في تطبيقات متنوعة، بما في ذلك هضم إنزيمات التقييد، وتسلسل الحمض النووي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي، ونقل الجينات إلى خلايا الثدييات، ولا يُشكل أي مشكلة للتطبيقات اللاحقة. س: هل يُمكنني استخدام الحمض النووي المُستخلص من مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110) لنقل الجينات؟ ج: نعم. لقد نجحنا في نقل البلازميدات المُحضرة باستخدام مجموعتنا إلى خطوط خلايا HEK 293 باستخدام كاشف Lipofectamine 3000، بكفاءة مماثلة لموردي مجموعات تحضير البلازميدات المصغرة الرائدين في السوق. س: هل أعمدة الطرد المركزي من Monarch متوافقة مع مشعبات التفريغ؟ ج: لقد تحققنا من صحة أعمدة مجموعات Monarch التالية للاستخدام مع مشعبات التفريغ الشائعة على سطح العمل: مجموعة تحضير البلازميد المصغر (NEB #T1010)، ومجموعة استخلاص الحمض النووي من الجل (NEB #T1020)، ومجموعة تنقية الحمض النووي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (NEB #T1030)، ومجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي (NEB #T2030، #T2040، #T2050). يمكن استخدام مشعبات التفريغ مع أعمدة Monarch الأخرى، ولكن قد يتطلب ذلك تحسينًا و/أو وقتًا إضافيًا لتدفق السائل بالكامل. س: هل تضمن مجموعة Monarch® Spin لتحضير البلازميد المصغر (NEB #T1110) استخلاص الحمض النووي البلازميدي خاليًا من السموم الداخلية؟ ج: على الرغم من أن محلول Monarch WZ (محلول الغسيل 1) يزيل غالبية السموم الداخلية من العينة، إلا أنه لا يمكن ضمان خلو الحمض النووي المستخلص تمامًا من السموم الداخلية. مع ذلك، فقد نجحنا في استخدام الحمض النووي البلازميدي المستخلص باستخدام مجموعاتنا لنقل الجينات إلى سلالات خلوية قوية. بينما قد يدّعي موردون آخرون أن مجموعات التحضير المصغرة الخاصة بهم "خالية من السموم الداخلية"، إلا أنه عادةً ما يبقى بعض السموم الداخلية قابلاً للقياس. س: لماذا قد يحدث انخفاض في كمية الحمض النووي البلازميدي أو ارتفاع في مستويات الحمض النووي الجينومي الملوث عند استخدام 5 مل من مزرعة الخلايا لعزل البلازميد باستخدام مجموعة Monarch® Spin Plasmid Miniprep Kit (NEB #T1110)، وكيف يمكن تحسين ذلك؟ ج: قد يشير انخفاض الكمية المستخلصة عند استخدام 5 مل من مزارع الخلايا إلى استخدام عدد كبير جدًا من الخلايا في عملية عزل البلازميد. على الرغم من أننا ننصح بأن مجموعتنا تستوعب ما يصل إلى 5 مل من المزرعة (≤OD 15)، إلا أن هناك بعض الحالات التي تكون فيها كثافة الخلايا عالية جدًا مع هذا الحجم. استخدام عدد كبير جدًا من الخلايا يمكن أن يؤدي إلى تحلل غير كامل للخلايا، وانخفاض إزالة الحمض النووي الجينومي المضيف، وانخفاض الكمية المستخلصة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحلل عدد كبير جدًا من الخلايا سيؤدي إلى إنتاج كميات زائدة من حطام الخلايا وحمض نووي جينومي ملوث، مما قد يُثقل العمود ويقلل من قدرته على ربط الحمض النووي البلازميدي. إذا تم حصاد مزرعة الخلايا بعد الانتقال إلى الطور الثابت، فإن استخدام حجم أقل من مزرعة الخلايا في عملية العزل قد يُحسّن من المردود. من المرجح أن يؤدي تقسيم مزرعة الخلايا (5 مل) إلى نصفين ومعالجتها في عمودين إلى نتائج أفضل. بدلاً من ذلك، قد يؤدي مضاعفة أحجام إعادة التعليق والتحلل والمعادلة إلى تحسين أداء العمود، ولكنه سيتطلب تحميل العمود مرتين، في كل مرة بنصف العينة المُعادلة. س: هل يمكن استخدام مكونات مجموعة Monarch® Plasmid Miniprep Kit القديمة (NEB #T1010) بشكل تبادلي مع مكونات الإصدار الجديد من المجموعة (Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit، NEB #T1110)؟ ج: نعم، على الرغم من أن الإصدار الجديد من مجموعة Monarch Spin Plasmid Miniprep Kit قد طُوّر بتحسينات على كلٍّ من العمود الفيزيائي وتركيب المحلول المنظم، إلا أن مكونات الإصدار السابق متوافقة مع المجموعة المُحدَّثة. سيظل الحمض النووي البلازميدي المُنقّى عالي الجودة، ومناسبًا لمختلف التطبيقات اللاحقة؛ ومع ذلك، قد يكون هناك اختلاف في الكمية المُنتَجة يصل إلى 20% في بعض الحالات. س: قبل الاستخدام، كيف أُحضّر المحاليل المنظمة؟ هل أحتاج إلى إضافة الإيزوبروبانول و/أو الإيثانول إلى المحاليل المنظمة قبل الاستخدام؟ ج: نعم، يجب إضافة الإيزوبروبانول والإيثانول إلى محلولي Monarch Buffer BZ وMonarch Buffer WZ قبل الاستخدام. يجب إضافة إنزيم Monarch RNase A إلى محلول Monarch Buffer B1 قبل الاستخدام، ثم يُخزَّن المحلول المنظم عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يُرجى مراجعة دليل تحضير المحاليل المنظمة (NEB #T1110) الذي يحتوي على تعليمات مُحدَّدة للمجموعات حول تحضير هذه المحاليل المنظمة للاستخدام. س: لاحظتُ أنني أبذل جهدًا لإدخال العمود في أنبوب التجميع. هل هذا طبيعي؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: تُرفق أنابيب تجميع مُطابقة مع جميع مجموعات Monarch® لأعمدة الطرد المركزي. إذا استخدمتَ أنابيب تجميع من خارج المجموعة، فيُرجى استخدام أنابيب تجميع Monarch® Spin (NEB #T2118). تجنّب إدخال أي عمود في أنابيب تجميع غير مُوصى بها ذات مقاس ضيق جدًا لتفادي تلف العمود. س: أرى بعض بقايا السيليكا في عمود Monarch. هل هذه مشكلة؟ ج: لا، هذه ليست مشكلة. وجود بعض بقايا السيليكا أو جزيئاتها في عمود تنقية الأحماض النووية لا يؤثر على ارتباط الأحماض النووية أو نقائها. صُممت أعمدتنا للاحتفاظ بألياف السيليكا، مما يضمن عدم وصولها إلى المُستخلص النهائي. س: لم يتم تخزين الإنزيمات الموجودة في المجموعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية فورًا. هل ستظل فعّالة؟ ج: نعم، إن إنزيم مونارك RNase A غير المفتوح يبقى مستقراً في درجات الحرارة المحيطة لفترة قصيرة. بعد الفتح، يجب تخزين إنزيم مونارك RNase A عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.