نيو إنجلاند بيولابس، T2037L، أعمدة الدوران مونارك® S1A والأنابيب

يمكن استخدام أعمدة وأنابيب Monarch Spin S1A لتنقية ما يصل إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي الناتج عن التفاعلات الإنزيمية. الفئات ذات الصلة: تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، استخلاص وتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، أسئلة شائعة حول تنقية الأحماض النووية. س: ما هي أقصى سعة ارتباط للعمود المرفق مع مجموعة Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: على الرغم من ملاحظة زيادة في كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) في بعض الحالات، إلا أن المادة الأساسية المرفقة في كل عمود كافية لارتباط الكميات التالية من الحمض النووي الريبوزي (RNA): T2030/T2037: 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA)، T2040/T2047: 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA)، T2050/T2057: 500 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA). من المهم ملاحظة أن التفاعلات الإنزيمية تُدخل مكونات مثل المنظفات والأصباغ والبروتينات والنيوكليوتيدات، والتي قد تتنافس جميعها على الارتباط بالغشاء أثناء عملية التنقية وتؤثر على استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA). س: ما هو أصغر حجم من الماء الخالي من النيوكلياز الذي يمكن استخدامه للاستخلاص باستخدام أعمدة مونارك سبين S1A وS2A وS2B لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: T2030/T2037: 6 ميكرولتر؛ أحجام الاستخلاص النموذجية تتراوح بين 6 و20 ميكرولتر. T2040/T2047: 20 ميكرولتر؛ أحجام الاستخلاص النموذجية تتراوح بين 20 و50 ميكرولتر. T2050/T2057: 50 ميكرولتر؛ أحجام الاستخلاص النموذجية تتراوح بين 50 و100 ميكرولتر. من المرجح أن يؤدي استخدام أحجام استخلاص أقل إلى تباين في النتائج بسبب عدم انتظام ترطيب المادة. قد يزداد المردود قليلاً عند استخدام حجم أكبر، ولكن سيكون تركيز الحمض النووي الريبوزي (RNA) أقل. *يمكن إجراء استخلاص ثانٍ لزيادة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى أقصى حد. يمكن إجراء عملية الاستخلاص الثانية باستخدام كمية جديدة من الماء الخالي من النيوكلياز أو باستخدام المذيب من عملية الاستخلاص الأولى لزيادة الاستخلاص إلى أقصى حد مع تقليل الحجم. استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin بأحجام استخلاص مختلفة: تم تنقية الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) (10 أو 50 أو 500 ميكروغرام، على التوالي، من معيار الريبوسوم 16S و23S من الإشريكية القولونية، سيجما) باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (10 ميكروغرام، NEB #T2030) (50 ميكروغرام، NEB #T2040) (500 ميكروغرام، NEB #T2050). تم استخدام الماء الخالي من النيوكلياز لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي. تم حساب نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر (A260) باستخدام جهاز Trinean DropSense 16. يمكن استخلاص حوالي 80% من الحمض النووي الريبوزي بكفاءة في 6 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (10 ميكروغرام، NEB #T2030)، و20 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 ميكروغرام، NEB #T2040)، و50 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (500 ميكروغرام، NEB #T2050). سؤال: هل يمكنني تحسين استخلاص الحمض النووي الريبوزي باستخدام مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kit إذا قمت بعملية استخلاص ثانية باستخدام نفس المذيب المستخدم في عملية الاستخلاص الأولى؟ جواب: نعم، يمكن إجراء عملية استخلاص ثانية لزيادة استخلاص الحمض النووي الريبوزي إلى أقصى حد. يمكن إجراء هذه العملية باستخدام كمية جديدة من الماء الخالي من النيوكلياز أو باستخدام نفس المذيب المستخدم في عملية الاستخلاص الأولى، وذلك لزيادة الاستخلاص إلى أقصى حد مع تقليل الحجم. س: ما العوامل التي تؤثر على نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى الامتصاص عند 230 نانومتر عند استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين؟ ج: يمكن أن يقلل كل من الغوانيدين والإيثانول، اللذان يُضافان أثناء التحضير، من نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى الامتصاص عند 230 نانومتر. اتباع البروتوكول، وخاصة خطوات الغسل، يضمن إزالة هذين المكونين. س: ما حجم الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يمكن تنقيته باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين؟ ج: باستخدام البروتوكول القياسي، يمكن تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يبلغ طوله 25 نيوكليوتيدًا أو أكثر. مع تعديل بسيط في البروتوكول (إضافة حجمين من الإيثانول بدلًا من حجم واحد بعد إضافة محلول الربط)، يمكن تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) الذي يزيد طوله عن 15 نيوكليوتيدًا. استخلاص الحمض النووي الريبوزي الصغير باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين. تم تنقية جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المصنعة (1 ميكروغرام في 50 ميكرولتر من الماء) بأطوال مختلفة (15-100 نيوكليوتيد) باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2040)، ثم تم إذابتها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. حُسبت نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الامتصاص الضوئي عند 260 نانومتر، والذي تم قياسه باستخدام جهاز Trinean DropSense™ 16. يؤدي البروتوكول القياسي لمجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit إلى استخلاص وتنظيف أكثر من 70% من الحمض النووي الريبوزي (RNA) بطول 25 نيوكليوتيد أو أكبر، بينما يؤدي استخدام البروتوكول المعدل (إضافة حجمين من الإيثانول في الخطوة 2) إلى استخلاص وتنظيف أكثر من 70% من جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأصغر حجمًا (حتى 15 نيوكليوتيد). يرجى ملاحظة أن استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (أقل من 45 نيوكليوتيدًا) قد يتأثر بالتسلسل، والتفاعلات مع الأحماض النووية الأخرى، و/أو البنية الثانوية. تؤثر البنية الثانوية على استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (أقل من 45 نيوكليوتيدًا). ​​تم تنقية جزيئات الحمض النووي الريبوزي المصنعة (1 ميكروغرام في 50 ميكرولتر من الماء) بأطوال مختلفة (25-40 نيوكليوتيدًا) وبنية ثانوية متوقعة متفاوتة* باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2040) وتم إذابتها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. تم حساب النسبة المئوية لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام جهاز Trinean DropSense™ 16. تم استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (25-40 نيوكليوتيدًا) ذات البنية الثانوية المتوقعة المنخفضة بكفاءة باستخدام البروتوكول القياسي لمجموعة Spin Monarch RNA Cleanup Kit. مع ذلك، فإن زيادة مستويات البنية الثانوية تقلل من استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (بطول 25-40 نيوكليوتيدًا). يمكن عادةً زيادة نسبة الاستخلاص إلى أكثر من 70% (الخط البرتقالي) باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Spin Monarch مع البروتوكول المُعدَّل (إضافة حجمين من الإيثانول في الخطوة 2). *تم التنبؤ بالبنية الثانوية باستخدام خادم RNAstructure على الويب: رويتر، جيه إس، وماثيوز، دي إتش (2010). RNAstructure: برنامج للتنبؤ بالبنية الثانوية للحمض النووي الريبوزي وتحليلها. BMC Bioinformatics. 11,129. في حال ملاحظة انخفاض في إنتاجية الحمض النووي الريبوزي الصغير باستخدام بروتوكول تنظيف الحمض النووي الريبوزي القياسي (إضافة حجم واحد من الإيثانول قبل الارتباط بالعمود)، نوصي باستخدام البروتوكول المُعدَّل (إضافة حجمين من الإيثانول قبل الارتباط بالعمود)، والذي يستخدم نسبة أعلى من الإيثانول إلى العينة لتغيير حد الاستبعاد وتمكين التقاط جزيئات الحمض النووي الريبوزي الأصغر. س: هل يمكنني استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin لتنظيف الحمض النووي الريبوزي المُعالَج بإنزيم DNase I؟ ج: نعم، ستزيل مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين نشاط إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز I المتبقي (NEB #M0303) من عينات الحمض النووي الريبوزي. غالبًا ما يؤدي استخدام إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز I أثناء عملية الفصل إلى بقاء نشاطه، لذا لا نوصي باستخدامه مع مجموعة مونارك سبين، بل نوصي باستخدامه في المحلول قبل عملية التنظيف. س: هل يمكنني استخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي من مونارك سبين لتنقية الحمض النووي الريبوزي من هلام الأغاروز؟ ج: نعم، يحتوي دليل استخدام مجموعة مونارك سبين على بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبوزي من هلام الأغاروز، مع العلم أن هذا ليس استخدامها الأساسي. تتراوح نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي من الأغاروز بين 40 و70%، وهي أقل من النسبة المتوقعة لتنقية الحمض النووي الريبوزي من التفاعلات الإنزيمية. يمكن أيضًا الاطلاع على البروتوكول عبر الإنترنت. س: هل يمكنني استخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin لتنظيف الحمض النووي الريبوزي بعد استخلاصه باستخدام TRIzol®/الكلوروفورم؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin لتنظيف الطور المائي من أي عملية استخلاص باستخدام غوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم، مما يُغني عن خطوات ترسيب الحمض النووي الريبوزي المُرهقة. يمكن الاطلاع على البروتوكول عبر الإنترنت أو في دليل المنتج. س: هل مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin متوافقة مع كواشف Luna RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى باستخدام هذه المجموعات في تفاعل RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. س: هل مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin متوافقة مع كواشف NEBNext لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُنقّى باستخدام هذه المجموعة لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام كواشف NEBNext RNA Library Prep من NEB. س: هل الأعمدة في مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup هي نفسها الموجودة في مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit (NEB #T2010)؟ ج: لا، الأعمدة في مجموعات Monarch RNA Cleanup Kits (NEB #T2030 و#T2040 و#T2050) ليست هي نفسها الموجودة في مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit (NEB #T2010). س: هل يمكنني شراء محاليل Monarch® والأعمدة بشكل منفصل؟ ج: تتوفر أعمدة Monarch spin والعديد من محاليل Monarch وكواشفها بشكل منفصل أيضًا. س: هل يمكنني إجراء معالجة DNase I على العمود باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: لن تتم إزالة إنزيم DNase I بالكامل عند استخدامه للهضم داخل العمود مع أعمدة Monarch لتنقية الحمض النووي الريبوزي (أعمدة Monarch Spin S1A، S2A، S2B). يُنصح بمعالجة المحلول بإنزيم DNase I، متبوعًا بتنقية الحمض النووي الريبوزي. س: هل يمكن استخدام مجموعات Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي (NEB #T2030، #T2040، #T2050) لتنقية الحمض النووي؟ ج: لقد استخدمنا بنجاح مجموعات Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي لتنقية الحمض النووي الريبوزي، والحمض النووي أحادي السلسلة، والحمض النووي ثنائي السلسلة. مع ذلك، وللحصول على أفضل تنقية للحمض النووي، نوصي باستخدام مجموعة Monarch Spin لتنقية الحمض النووي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (NEB #T1130). س: هل يمكن استخدام مجموعات Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي؟ ج: نعم. على الرغم من أنها طُوّرت في الأصل لتطبيقات تنقية الحمض النووي الريبوزي، إلا أنه يمكن استخدام هذه المجموعات أيضًا لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الخلايا، واللعاب، وعينات المسحات. عند استخدام هذه التقنية لاستخلاص الفيروسات، يجب استخدام كاشف حماية الحمض النووي (DNA/RNA) من مونارك (يُباع منفصلاً، NEB #T2011) لتعطيل الفيروسات. للمزيد من المعلومات، يُرجى مراجعة بروتوكولاتنا الإلكترونية: استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي من مونارك سبين، استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مسحات الخد/البلعوم الأنفي باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي من مونارك سبين، استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من اللعاب باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي من مونارك سبين، أتمتة استخلاص الحمض النووي الريبوزي الفيروسي من اللعاب باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي من مونارك سبين. س: لاحظتُ أنني أبذل جهدًا لإدخال العمود في أنبوب التجميع. هل هذا طبيعي؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: تُرفق أنابيب تجميع مُطابقة مع جميع مجموعات مونارك® لأعمدة الدوران. في حال استخدام أنابيب تجميع من خارج المجموعة، يُرجى استخدام أنابيب تجميع مونارك® سبين (NEB #T2118). تجنب إدخال أي أعمدة في أنابيب تجميع غير مُوصى بها ذات إحكام شديد لتفادي تلف العمود. س: ألاحظ وجود بعض بقايا السيليكا في عمود مونارك. هل يُعدّ هذا مشكلة؟ ج: لا، ليس هذا مشكلة. إن وجود بعض بقايا السيليكا أو جزيئاتها في عمود تنقية الأحماض النووية لا يؤثر على ارتباط الأحماض النووية أو نقائها. صُممت أعمدتنا لاحتجاز ألياف السيليكا، مما يضمن عدم وصولها إلى المُستخلص النهائي. س: كيف يُمكنني تقييم سلامة ونقاء الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: يُمكن تقييم نقاء عينات الحمض النووي الريبوزي المُستخلصة بسرعة من خلال مراجعة نسب الامتصاص الضوئي (OD) التي تم جمعها أثناء قياس الطيف الضوئي الروتيني. عادةً ما يكون للحمض النووي الريبوزي النقي نسبة امتصاص ضوئي عند 260/280 نانومتر تتراوح بين 1.9 و2.1، ونسبة امتصاص ضوئي عند 260/230 نانومتر تتراوح بين 2.0 و2.2. يمكن أن تؤثر عوامل عديدة على هذه القيم، مثل استخدام محلول مرجعي مناسب، ودرجة حموضة المحلول المنظم، والملوثات مثل البروتين، وأملاح المحلول المنظم، والإيثانول، وما إلى ذلك. لمزيد من المعلومات حول هذا الموضوع، يرجى الاطلاع على تقييم الحمض النووي الريبي (RNA).