نيو إنجلاند بيولابس، T2047L، أعمدة الدوران مونارك® S2A

الفئات ذات الصلة: تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA)، استخلاص وتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA)، أسئلة شائعة حول تنقية الأحماض النووية. س: لاحظتُ أنني أضغط على العمود لإدخاله في أنبوب التجميع. هل هذا صحيح؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: تُرفق أنابيب تجميع مُطابقة مع جميع مجموعات Monarch® لأعمدة الطرد المركزي. في حال استخدام أنابيب تجميع من خارج المجموعة، يُرجى استخدام أنابيب تجميع Monarch® Spin (NEB #T2118). تجنب إدخال أي عمود بالقوة في أنابيب تجميع غير مُوصى بها ذات مقاس ضيق جدًا لتفادي تلف العمود. س: هل يُمكن استخدام مجموعات Monarch Spin لتنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)؟ ج: نعم. على الرغم من أنها طُوّرت في الأصل لتطبيقات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA)، إلا أنه يُمكن استخدام هذه المجموعات أيضًا لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا واللعاب وعينات المسحات. عند استخدامها لاستخلاص الفيروسات، يجب استخدام كاشف حماية الحمض النووي (DNA/RNA) من Monarch (يُباع بشكل منفصل، NEB #T2011) لتعطيل الفيروسات. للحصول على مزيد من المعلومات، تفضل بزيارة بروتوكولاتنا الإلكترونية: استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin، استخلاص الحمض النووي الريبوزي من مسحات الفم/البلعوم الأنفي باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin، استخلاص الحمض النووي الريبوزي من اللعاب باستخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin، أتمتة استخلاص الحمض النووي الريبوزي الفيروسي من اللعاب باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin. س: ما العوامل التي تؤثر على نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى الامتصاص عند 230 نانومتر (A260/A230) عند استخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin؟ ج: يمكن أن يقلل كل من الغوانيدين والإيثانول، اللذان يُضافان أثناء التحضير، من نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى الامتصاص عند 230 نانومتر. اتباع البروتوكول، وخاصة خطوات الغسل، يضمن إزالة هذه المكونات. س: هل يمكنني شراء محاليل وأعمدة Monarch® بشكل منفصل؟ ج: تتوفر أعمدة Monarch Spin والعديد من محاليل وكواشف Monarch بشكل منفصل أيضًا. س: ألاحظ وجود بعض بقايا السيليكا في عمود Monarch الخاص بي. هل هذه مشكلة؟ ج: لا، هذه ليست مشكلة. لا يؤثر وجود بعض بقايا السيليكا أو جزيئاتها في عمود تنقية الأحماض النووية على ارتباط الأحماض النووية أو نقائها. صُممت أعمدتنا لاحتجاز ألياف السيليكا، مما يضمن عدم وصولها إلى المستخلص النهائي. س: هل الأعمدة الموجودة في مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kits هي نفسها الموجودة في مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit (NEB #T2010)؟ ج: لا، الأعمدة الموجودة في مجموعات Monarch RNA Cleanup Kits (NEB #T2030 و#T2040 و#T2050) تختلف عن تلك الموجودة في مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit (NEB #T2010). س: هل يمكنني استخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعالج بإنزيم DNase I؟ ج: نعم، ستزيل مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kits بقايا نشاط إنزيم DNase I (NEB #M0303) من عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA). قد يؤدي استخدام إنزيم DNase I على العمود إلى بقاء بعض نشاطه، لذا لا نوصي باستخدامه على العمود مع مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit، بل نوصي باستخدامه في المحلول قبل تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA). س: هل تتوافق مجموعات Monarch Spin RNA Cleanup Kit مع كواشف NEBNext لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي المنقى بهذه المجموعة لتحضير مكتبات الحمض النووي الريبوزي باستخدام كواشف NEBNext RNA Library Prep من NEB. س: ما هي أقصى سعة ارتباط للعمود المرفق مع مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit؟ ج: على الرغم من ملاحظة زيادة في كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) في بعض الحالات، إلا أن المادة المضافة في كل عمود كافية لربط الكميات التالية من الحمض النووي الريبوزي: T2030/T2037: 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي، T2040/T2047: 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي، T2050/T2057: 500 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي. من المهم ملاحظة أن التفاعلات الإنزيمية تُدخل مكونات مثل المنظفات والأصباغ والبروتينات والنيوكليوتيدات، والتي قد تتنافس جميعها على الارتباط بالغشاء أثناء عملية التنقية وتؤثر على استخلاص الحمض النووي الريبوزي. س: هل يُمكنني الحصول على استخلاص أفضل باستخدام مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin إذا قمتُ بعملية استخلاص ثانية باستخدام نفس المُذيب من عملية الاستخلاص الأولى؟ ج: يُمكن إجراء عملية استخلاص ثانية لزيادة استخلاص الحمض النووي الريبوزي إلى أقصى حد. يُمكن إجراء هذه العملية باستخدام كمية جديدة من الماء الخالي من النيوكلياز أو باستخدام المُذيب من عملية الاستخلاص الأولى لزيادة الاستخلاص إلى أقصى حد مع تقليل الحجم. س: هل يمكنني استخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kits لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من هلام الأغاروز؟ ج: نعم، يحتوي دليل مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit على بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبوزي من هلام الأغاروز، مع أن هذا ليس استخدامها الأساسي. تتراوح نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي من الأغاروز بين 40 و70%، وهي أقل من النسبة المتوقعة لتنقية الحمض النووي الريبوزي من التفاعلات الإنزيمية. يمكن أيضًا الوصول إلى البروتوكول عبر الإنترنت. س: ما هو حجم الحمض النووي الريبوزي الذي يمكن تنقيته باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit؟ ج: باستخدام البروتوكول القياسي، يمكن تنقية الحمض النووي الريبوزي الذي يبلغ طوله 25 نيوكليوتيدًا أو أكثر. مع تعديل بسيط في البروتوكول (إضافة حجمين من الإيثانول بدلًا من حجم واحد بعد إضافة محلول الربط)، يمكن تنقية الحمض النووي الريبوزي الذي يزيد طوله عن 15 نيوكليوتيدًا. استخلاص الحمض النووي الريبوزي الصغير باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit. تم تنقية جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) المصنعة (1 ميكروغرام في 50 ميكرولتر من الماء) بأطوال مختلفة (15-100 نيوكليوتيد) باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2040)، ثم تم إذابتها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. حُسبت نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الامتصاص الضوئي عند 260 نانومتر، والذي تم قياسه باستخدام جهاز Trinean DropSense™ 16. يؤدي البروتوكول القياسي لمجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit إلى استخلاص وتنظيف أكثر من 70% من الحمض النووي الريبوزي (RNA) بطول 25 نيوكليوتيد أو أكبر، بينما يؤدي استخدام البروتوكول المعدل (إضافة حجمين من الإيثانول في الخطوة 2) إلى استخلاص وتنظيف أكثر من 70% من جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأصغر حجمًا (حتى 15 نيوكليوتيد). يرجى ملاحظة أن استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (أقل من 45 نيوكليوتيدًا) قد يتأثر بالتسلسل، والتفاعلات مع الأحماض النووية الأخرى، و/أو البنية الثانوية. تؤثر البنية الثانوية على استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (أقل من 45 نيوكليوتيدًا). ​​تم تنقية جزيئات الحمض النووي الريبوزي المصنعة (1 ميكروغرام في 50 ميكرولتر من الماء) بأطوال مختلفة (25-40 نيوكليوتيدًا) وبنية ثانوية متوقعة متفاوتة* باستخدام مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2040) وتم إذابتها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. تم حساب النسبة المئوية لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام جهاز Trinean DropSense™ 16. تم استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (25-40 نيوكليوتيدًا) ذات البنية الثانوية المتوقعة المنخفضة بكفاءة باستخدام البروتوكول القياسي لمجموعة Spin Monarch RNA Cleanup Kit. مع ذلك، فإن زيادة مستويات البنية الثانوية تقلل من استخلاص جزيئات الحمض النووي الريبوزي الصغيرة (بطول 25-40 نيوكليوتيدًا). يمكن عادةً زيادة نسبة الاستخلاص إلى أكثر من 70% (الخط البرتقالي) باستخدام مجموعة Spin Monarch RNA Cleanup Kit مع البروتوكول المُعدَّل (إضافة حجمين من الإيثانول في الخطوة 2). *تم التنبؤ بالبنية الثانوية باستخدام خادم RNAstructure Web Server: Reuter, JS, & Mathews, DH (2010). RNAstructure: برنامج للتنبؤ بالبنية الثانوية للحمض النووي الريبي وتحليلها. BMC Bioinformatics. 11,129. في حال ملاحظة انخفاض في كمية الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام بروتوكول تنظيف الحمض النووي الريبي القياسي (إضافة حجم واحد من الإيثانول قبل الارتباط بالعمود)، نوصي باستخدام البروتوكول المُعدَّل (إضافة حجمين من الإيثانول قبل الارتباط بالعمود)، والذي يستخدم نسبة أعلى من الإيثانول إلى العينة لتغيير حد الاستبعاد وتمكين التقاط جزيئات الحمض النووي الريبي الأصغر. س: أرغب في تنظيف حوالي 150 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. هل من الأفضل استخدام عدة أعمدة سعة 50 ميكروغرام (NEB #T2040/#T2047) أم عمود واحد سعة 500 ميكروغرام (NEB #T2050/#T2057)؟ ج: نوصي باستخدام عمود سعة 500 ميكروغرام (NEB #T2050/#T2057) لتنقية 150 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) بدلاً من 3-4 أعمدة سعة 50 ميكروغرام. نتوقع استرداد ما لا يقل عن 80-90% من 150 ميكروغرام باستخدام عمود 500 ميكروغرام، وسيكون ذلك أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنةً باستخدام عدة أعمدة ذات سعة أقل. مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن عمود 500 ميكروغرام يتطلب حضانة لمدة 5 دقائق مع ماء خالٍ من النيوكلياز أثناء عملية الاستخلاص، لذا فإن مدة العملية أطول قليلاً. س: هل تتوافق مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin مع كواشف Luna RT-qPCR؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقى باستخدام هذه المجموعات في تفاعل RT-qPCR مع جميع مجموعات Luna One-Step RT-qPCR من NEB ومنتجات LunaScript® RT. س: هل يمكن استخدام مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin (NEB #T2030، #T2040، #T2050) لتنقية الحمض النووي (DNA) أيضًا؟ ج: لقد استخدمنا بنجاح مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin لتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) والحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA). ومع ذلك، للحصول على أفضل تنقية للحمض النووي (DNA)، نوصي باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والحمض النووي (DNA) من Monarch Spin (NEB #T1130). س: هل يمكنني استخدام مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من Monarch Spin لتنقية تفاعل النسخ المختبري (IVT)؟ ج: نعم، مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (50 ميكروغرام) (NEB #T2040) مناسبة لتنظيف تفاعلات النسخ المختبري التي لا يُتوقع أن يتجاوز ناتجها 50 ميكروغرام. إذا كان من المتوقع أن يتجاوز ناتج الحمض النووي الريبوزي (RNA) في عملية النسخ المختبري 50 ميكروغرام، فنوصي بتقسيم التفاعل على عدة أعمدة من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (50 ميكروغرام) أو تنظيفه باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين (500 ميكروغرام) (NEB #T2050)، نظرًا لقدرتها الأكبر على الارتباط بالحمض النووي الريبوزي (RNA). س: هل يمكنني استخدام مجموعات تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين لتنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) بعد استخلاصه باستخدام TRIzol®/الكلوروفورم؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك سبين لتنظيف الطور المائي من أي عملية استخلاص باستخدام غوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم، مما يُغني عن الحاجة إلى خطوات ترسيب الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُرهقة. يمكن الوصول إلى البروتوكول عبر الإنترنت أو في دليل المنتج. س: هل يمكنني إجراء معالجة DNase I على العمود باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA Cleanup)؟ ج: لن تتم إزالة DNase I بالكامل عند استخدامها للهضم على العمود باستخدام أعمدة Monarch لتنقية الحمض النووي الريبوزي (أعمدة Monarch Spin S1A، S2A، S2B). يُوصى بمعالجة DNase I في المحلول، متبوعةً بتنقية الحمض النووي الريبوزي. س: ما هو أصغر حجم من الماء الخالي من النيوكلياز الذي يمكن استخدامه للاستخلاص باستخدام أعمدة Monarch Spin S1A، S2A، S2B لتنقية الحمض النووي الريبوزي؟ ج: T2030/T2037: 6 ميكرولتر؛ أحجام الاستخلاص النموذجية هي 6-20 ميكرولتر. T2040/T2047: 20 ميكرولتر؛ أحجام الاستخلاص النموذجية هي 20-50 ميكرولتر. T2050/T2057: 50 ميكرولتر. تتراوح أحجام الإذابة النموذجية بين 50 و100 ميكرولتر. استخدام أحجام إذابة أقل قد يؤدي إلى تباين في النتائج نتيجة عدم انتظام ترطيب المادة. قد يزداد المردود قليلاً عند استخدام حجم أكبر، ولكن سيكون تركيز الحمض النووي الريبي أقل. *يمكن إجراء عملية إذابة ثانية لزيادة استخلاص الحمض النووي الريبي إلى أقصى حد. يمكن إجراء هذه العملية باستخدام كمية جديدة من الماء الخالي من النيوكلياز أو باستخدام المذيب من عملية الإذابة الأولى لزيادة الاستخلاص إلى أقصى حد مع تقليل الحجم. استُخلص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مجموعات تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin باستخدام أحجام استخلاص مختلفة. تم تنقية الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) (10، 50، أو 500 ميكروغرام، على التوالي، من معيار الريبوسوم 16S و23S من الإشريكية القولونية، سيغما) باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (10 ميكروغرام، NEB #T2030) (50 ميكروغرام، NEB #T2040) (500 ميكروغرام، NEB #T2050). استُخدم الماء الخالي من النيوكلياز لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي. تم حساب نسبة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر (A260) باستخدام جهاز Trinean DropSense 16. يمكن استخلاص حوالي 80% من الحمض النووي الريبوزي بكفاءة في 6 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (10 ميكروغرام، NEB #T2030)، و20 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 ميكروغرام، NEB #T2040)، و50 ميكرولتر من مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (500 ميكروغرام، NEB #T2050). سؤال: هل مجموعة Monarch Spin RNA Cleanup Kit (NEB #T2040) متوافقة مع مجموعة EnGen sgRNA Synthesis Kit الخاصة ببكتيريا S. pyogenes؟ ج: نعم، يمكن تنظيف sgRNAs المصنعة باستخدام EnGen sgRNA Synthesis Kit، S. pyogenes (NEB #E3322) باستخدام Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 µg، NEB #T2040) قبل تكوين معقدات البروتين النووي الريبي (RNP) والتحويل الكهربائي اللاحق إلى الخلايا.