نيو إنجلاند بيولابس، T3005L، خرزات التقاط الحمض النووي مونارك®

الفئات ذات الصلة: استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، استخلاص وتنقية الحمض النووي الجينومي، تنقية الأحماض النووية. الأسئلة الشائعة: س: سقطت مني بعض خرزات الزجاج. هل يمكنني تنظيفها، وهل توفرون خرزات إضافية؟ ج: توفر NEB كمية إضافية من الخرزات تحسبًا لسقوطها. في مجموعات التحضير الخماسية، نوفر خرزتين إضافيتين، وفي مجموعات التحضير الخمسينية، نوفر ما بين 5 إلى 7 خرزات إضافية. كما تتوفر خرزات Monarch DNA Capture للشراء بشكل منفصل (NEB #T3005). بالإضافة إلى ذلك، يمكن غسل أي خرزات تسقط بمحلول منظف (مثل 2% SDS أو RNaseZap)، ثم شطفها بالماء والإيثانول 70%، وتجفيفها، ثم استخدامها. س: هل هناك أي شيء مميز في خرزات Monarch DNA Capture، أم يمكنني استخدام أي خرزات زجاجية؟ ج: خرزات Monarch DNA Capture هي خرزات زجاجية متخصصة من البوروسيليكات، مُحسَّنة لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في عملية استخلاص Monarch. على الرغم من أن أنواعًا أخرى من الخرز الزجاجي قد تنجح في تنقية الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، إلا أن خرز Monarch Capture Beads يوفر أداءً مثاليًا في التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل Nanopore. لا يمكننا ضمان أداء مماثل باستخدام أي خرز زجاجي آخر غير المرفق. س: كيف أعرف أن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي قد التصق بالخرز الزجاجي في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch؟ ج: عندما تحتوي العينات على أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وهو أمر شائع عند العمل بكميات "المدخلات القياسية"، يكون ارتباط الحمض النووي بالخرز مرئيًا على شكل طبقة ضبابية معتمة تغطي الخرز. سيبقى الخرز ملتصقًا ببعضه بعد ارتباط هذه الكمية من الحمض النووي به. عند إجراء عمليات الانعكاس يدويًا باستخدام كميات "المدخلات القياسية"، يمكن رؤية عملية الارتباط ومتابعتها. بعد 5 عمليات انعكاس، يصبح الحمض النووي الضبابي مرئيًا، وفي عمليات الانعكاس العشر التالية، يرتبط بالخرز ويبدأ بالالتفاف حوله. عند هذه النقطة، يبقى المحلول لزجًا. بمجرد أن يلتف الحمض النووي بالكامل حول الخرز خلال الـ 10-15 دورة المتبقية، لن يكون المحلول لزجًا. عادةً ما تُنتج عينات "الإدخال المنخفض" ما بين 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وقد يكون من الصعب تتبع ارتباط الحمض النووي. إذا كان هناك 1-5 ميكروغرام فقط من الحمض النووي، فمن المحتمل ألا يكون من الممكن رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز؛ إذ سيبدو أن الخرز يتحرك بحرية وبشكل مستقل في المحلول. عندما يكون هناك ما بين 5-10 ميكروغرام من الحمض النووي، يصعب رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز، ولكن غالبًا ما يتسبب الحمض النووي المرتبط في التصاق الخرز ببعضه. س: هل هناك أي فائدة من إضافة عملية اختيار الحجم (مثل Circulomics® Short Read Eliminator) بعد الاستخلاص؟ ج: بحسب خبرة NEB، فإن خطوة اختيار الحجم ليست ضرورية عادةً قبل تسلسل النانوبور القائم على الربط. عند العمل بمواد أولية طازجة وعالية الجودة، تكون أطوال قراءة N50 عالية (35-55 كيلوبايت، حسب العينة)، ولن يُحسّن اختيار حجم إضافي للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) طول القراءة إلا بشكل طفيف. مع ذلك، عند العمل بمواد أولية أقل جودة، مثل تلك التي تم تخزينها بشكل غير مثالي، أو عند العمل بعينات يصعب تحليلها (مثل ذيل الفأر)، سيحتوي الحمض النووي الناتج على نسبة أكبر من الشظايا القصيرة. في هذه الحالات، قد يكون من المفيد إجراء خطوة إثراء للحصول على نتائج تسلسل أفضل؛ ويمكن استخدام أي منتج لاختيار الحجم (مثل مُزيل القراءات القصيرة) مع الحمض النووي المعزول باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch لمعالجة عينات الخميرة و/أو الفطريات؟ ج: لقد تحققنا من صحة مجموعتنا لمعالجة عينات الخميرة، ونشرنا بروتوكولًا قائمًا على العمل مع عينات S. cerevisiae. لم نختبر المجموعة داخليًا على الفطريات الخيطية. مع ذلك، استنادًا إلى عملنا في تطوير مجموعة السيليكا الخاصة بنا (NEB #T3010)، والتي تستخدم كيمياء تحلل مماثلة، وجدنا أن تركيبتنا الكيميائية قد تكون فعالة مع بعض أنواع الفطريات عند تجميد العينة في النيتروجين السائل وطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام الهاون والمدقة. أما بالنسبة للفطر، فيُفضل استخدام مادة أولية مجففة. مع ذلك، يتطلب هذا النهج اختباره على نوع الفطر المحدد. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة طبقة الكريات البيضاء البشرية؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة طبقة الكريات البيضاء. عند العمل مع طبقة الكريات البيضاء، وهي محلول مركز من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي، يجب استخدام كميات أقل من تلك المستخدمة عند العمل مع الدم. يجب ألا يتجاوز إجمالي عدد الخلايا 1 × 10⁷ خلية للبروتوكول القياسي (التحريك بسرعة 2000 دورة في الدقيقة)، ولا يتجاوز 5 × 10⁶ خلية عند الحاجة إلى الحمض النووي فائق الوزن الجزيئي (تحريك خفيف). تحتوي الطبقة البيضاء المستخلصة من بنوك الدم على ما يصل إلى 1 × 10⁹ خلية أحادية النواة في الدم المحيطي لكل 30-80 مل، أي ما يعادل تقريبًا 1 × 10⁷ إلى 3 × 10⁷ خلية/مل. نقترح البدء بـ 100-300 ميكرولتر من هذا المحلول، وإضافة محلول ملحي فوسفاتي (PBS) ليصل الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر، ثم إجراء عملية تحليل كريات الدم الحمراء كما لو كانت عينة دم بحجم 500 ميكرولتر. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من مونارك لمعالجة العينات البيئية أو البرازية لدراسات الميتاجينوم؟ ج: لا نوصي باستخدام مجموعتنا لمعالجة العينات البيئية كالتربة أو العينات البرازية. تواجه هذه العينات تحديين رئيسيين: احتواؤها على نسبة عالية جدًا من النيوكلياز، واحتوائها على مثبطات يصعب إزالتها (حمض الهيوميك في التربة، والأحماض الصفراوية في العينات البرازية). يؤدي عبء النيوكلياز إلى تدهور كبير في الحمض النووي، مما يجعله غير مناسب بطبيعته لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، ولن تتمكن التركيبة الكيميائية الحالية للمجموعة من إزالة المثبطات الموجودة في هذه العينات بفعالية. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لعزل الحمض النووي البكتيري الاصطناعي (BAC)؟ ج: لم نختبر ذلك، لكننا نتوقع أن ينجح الأمر لأن تركيبات BAC تقع ضمن النطاق الأمثل لحجم ارتباط الخرز. مع ذلك، عادةً ما تكون تركيبات BAC ذات عدد نسخ منخفض جدًا، وسيلزم كمية كبيرة من المزرعة لتجميع كمية كافية من الحمض النووي BAC لارتباط الخرز (> 5 ميكروغرام). سيؤدي هذا إلى زيادة أحجام المحاليل المنظمة اللازمة في التحلل القلوي. إجمالًا، يجب ألا يتجاوز حجم محاليل التحلل القلوي الثلاثة 1100 ميكرولتر حتى يظل الحمض النووي مرتبطًا بالخرز في أنبوب تفاعل سعة 2 مل. قد يتطلب الأمر بعض التحسينات، ولكن من الممكن ربط كيمياء التحلل القلوي بجزء ربط الخرز والتنقية في بروتوكولات مونارك. س: هل تعمل آلية استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك مع الخلايا المفردة؟ ج: للأسف، هذه الآلية غير متوافقة مع الخلايا المفردة. يتطلب النظام وجود كتلة حرجة من الحمض النووي (≥ 1 ميكروغرام في ~100 ميكرولتر) لضمان ارتباطه الفعال بالخرز. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة الديدان الأسطوانية؟ ج: نعم. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من دودة C. elegans باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060) باتباع البروتوكول القياسي لعينات الأنسجة (تمت معالجة ديدان من طبقين). نوصي باستخدام جهاز تجنيس دوار-ثابت لتجنيس العينة للحصول على أفضل النتائج. س: أواجه مشكلة في إذابة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد عزله. هل لديك أي نصائح لزيادة الذوبان؟ ج: من المعروف أن الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي (HMW DNA) يصعب إذابته. وعندما تكون عينات الحمض النووي عالية التركيز أو تحتوي على حمض نووي ذي وزن جزيئي فائق الارتفاع، يصبح إذابته أكثر صعوبة. بشكل عام، كلما زاد انضغاط الحمض النووي، زادت صعوبة إذابته. توفر حبيبات الزجاج المستخدمة في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك سطحًا واسعًا يلتف حوله الحمض النووي، مما يحافظ عليه في حالة مفتوحة، ويسهل إذابته. مع ذلك، قد تظل الذوبانية مشكلة. فيما يلي بعض النصائح لزيادة ذوبان الحمض النووي عند استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك: حاول تقليل مدة ارتباط الحمض النووي بالحبيبات دون وجود سائل. بعد إزالة السائل من الحبيبات، أضف المحلول المنظم التالي فورًا. كلما طالت مدة جفاف الحمض النووي على الحبيبات، زاد انضغاطه، وزادت صعوبة إذابته لاحقًا. عند ربط الحمض النووي بالحبيبات، لا تقلب العينة لفترة أطول من الموصى بها. كلما زاد الوقت الذي يلتف فيه الحمض النووي حول الخرز، ازداد تماسكه، وصعب إذابته لاحقًا. راجع دليل الاستخدام الخاص بنا، "تجانس عينات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) بعد الإذابة"، لمزيد من النصائح حول تجانس الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد الإذابة.