مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin من شركة New England Biolabs، طراز T3010S

اعتبارًا من 20 نوفمبر 2025، تم تحديث البروتوكولات لإزالة خطوة الدوران البطيء (1000 × g)، مما يُبسط سير العمل ويوفر الوقت. وقد أظهرت اختباراتنا عدم وجود أي تأثير على الأداء أو الإنتاجية. مجموعات تستخدم أعمدة مونارك سبين S2C ذات اللون البرتقالي ( الفئات ذات الصلة: استخلاص وتنقية الحمض النووي الجينومي، تطبيقات تنقية الأحماض النووية، الأسئلة الشائعة حول تنقية الأحماض النووية: س: ما هو تركيب كل محلول منظم مُرفق مع مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي مونارك سبين؟ ج: تركيب المحاليل المنظمة سرية. ومع ذلك، يمكننا مشاركة المعلومات التالية: محلول مونارك لتحليل الأنسجة: محلول تحليل قائم على المنظفات، محلول مونارك لتحليل الخلايا: محلول تحليل قائم على هيدروكلوريد الغوانيدينيوم، محلول مونارك لتحليل الدم: محلول تحليل قائم على هيدروكلوريد الغوانيدينيوم، محلول مونارك للربط: محلول ربط قائم على ثيوسيانات الغوانيدينيوم، محلول مونارك للغسل: محلول غسل قائم على الإيثانول، محلول مونارك للاستخلاص: 10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 9.0، 0.1 ملي مولار EDTA س: ما هي أقصى سعة ارتباط لأعمدة مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin؟ ج: ترتبط مصفوفة العمود بـ 25-30 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي (gDNA)، مع العلم أنه في بعض الحالات لوحظت كميات أكبر. من المهم ملاحظة أن سعة ارتباط المصفوفة ستنخفض في حال وجود كميات كبيرة من البروتينات أو السكريات غير القابلة للذوبان في المستخلص. يُرجى الرجوع إلى إرشاداتنا لاختيار كميات الإدخال لتجنب التحميل الزائد على الأعمدة. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان طول الحمض النووي الجينومي أكبر من 80 كيلوبايت، فلن يُمكن فصله بكفاءة من المصفوفة. س: ما هو الحد الأدنى لحجم الإذابة الذي يُمكن استخدامه مع أعمدة مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin؟ ج: الحد الأدنى لحجم الإذابة هو 35 ميكرولتر. وللحصول على أقصى استخلاص، يُوصى باستخدام 100 ميكرولتر. ستؤدي أحجام الإذابة الأصغر إلى عينات أكثر تركيزًا ولكن أيضًا إلى كمية أقل. عادةً، عند استخدام 35 ميكرولتر للإذابة، تكون الكمية التقريبية أقل بنسبة 20% مقارنةً باستخدام 100 ميكرولتر. استخدام أحجام استخلاص أقل من 35 ميكرولتر سيؤدي إلى ترطيب غير متجانس لمصفوفة السيليكا وانخفاض كبير في الاستخلاص. استخلاص الحمض النووي الجينومي باستخدام أحجام استخلاص مختلفة في مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin. يتراوح حجم الاستخلاص الأمثل بين 35 و100 ميكرولتر. تم تحضير مجموعة من المستخلصات باستخدام 10 ملغ من عينات كبد الفئران المثبتة بـ RNAlater®، باتباع بروتوكول أنسجة Monarch. كانت أحجام الاستخلاص المستخدمة في العينات الثلاثية 25، 30، 35، 40، 50، 75، و100 ميكرولتر. بلغ متوسط ​​العائد الذي تم الحصول عليه باستخدام حجم استخلاص 100 ميكرولتر 19.1 ميكروغرام، والذي اعتبر عائدًا بنسبة 100%. باستخدام 35 ميكرولتر للاستخلاص، بلغ متوسط ​​العائد 81.6%؛ 25 ميكرولتر و أعطى حجم 20 ميكرولتر نسبة استخلاص بلغت 74% و70.6% على التوالي. بالنسبة للأحجام ≥ 35 ميكرولتر، كان الحجم المستخلص بعد الإذابة أقل بحوالي 5 ميكرولتر من حجم الإذابة المضاف، وبالنسبة للأحجام < 30 ميكرولتر، كان الحجم المستخلص أقل بحوالي 10 ميكرولتر. أظهرت الاختبارات التي أُجريت باستخدام مواد أولية أخرى نتائج مماثلة، مع انخفاض بنسبة 20-25% في إجمالي الناتج عند تقليل أحجام الإذابة من 100 إلى 35 ميكرولتر. لمزيد من المعلومات، راجع "اعتبارات الإذابة والتخزين" في دليل المنتج. س: ما مدى أهمية تسخين محلول الإذابة مسبقًا إلى 60 درجة مئوية؟ هل 56 درجة مئوية مناسبة؟ ج: يُعد تسخين محلول الإذابة مسبقًا ضروريًا لتحقيق أقصى قدر من الاستخلاص باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin. إذا كان ذلك أكثر ملاءمة، يمكن استخدام درجة حرارة 56 درجة مئوية، ولكن قد يؤدي ذلك إلى انخفاض طفيف جدًا في الناتج. يمكن أيضًا استخدام محلول الإذابة بدرجة حرارة الغرفة، ولكن ذلك سيؤدي إلى... قد يؤدي ذلك إلى انخفاض في كمية الحمض النووي بنسبة 20-30%، وقد يتطلب الأمر عملية استخلاص ثانية. بالإضافة إلى ذلك، عند درجة حرارة الغرفة، ستكون عملية استخلاص شظايا الحمض النووي الجينومي الكبيرة أقل كفاءة، وبالتالي سيكون متوسط ​​حجم الحمض النووي الجينومي المستخلص أصغر. لمزيد من المعلومات، راجع قسم "اعتبارات الاستخلاص والتخزين" في دليل المنتج. سؤال: هل يمكنني الحصول على استخلاص أفضل باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin إذا قمت بعملية استخلاص ثانية باستخدام نفس المذيب من عملية الاستخلاص الأولى؟ جواب: تم ​​تحسين بروتوكول Monarch لتنقية الحمض النووي الجينومي لتحقيق أقصى سرعة وسهولة. تُمكّن خطوة الاستخلاص باستخدام محلول الاستخلاص المُسخّن مسبقًا من الحصول على أقصى استخلاص في خطوة واحدة فقط. ومع ذلك، يمكن إجراء خطوة استخلاص ثانية لزيادة الاستخلاص إلى أقصى حد. يمكن إجراء هذه الخطوة الثانية باستخدام جزء جديد من محلول استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch أو المذيب من عملية الاستخلاص الأولى، وذلك لتقليل تخفيف الحمض النووي. قد يتم تحقيق زيادة بنسبة 10% في إجمالي الكمية المستخلصة. لمزيد من المعلومات، راجع قسم "اعتبارات الاستخلاص والتخزين" في دليل المنتج. س: هل يمكنني استخدام محلول إذابة مختلف عن المحلول المرفق مع مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010)؟ ج: محلول الإذابة المرفق مع المجموعة هو 10 ملي مولار من Tris-HCl، درجة الحموضة 9.0، و0.1 ملي مولار من EDTA. هذا المحلول مثالي للتخزين طويل الأمد للحمض النووي الجينومي. يمكن استخدام أي محلول منخفض الملوحة للإذابة، مثل 10 ملي مولار من Tris-HCl بدرجة حموضة 8.5، أو محلول TE، أو الماء الخالي من النيوكلياز. تسخين محلول الإذابة مسبقًا إلى 60 درجة مئوية يضمن إذابة سريعة وفعالة للحمض النووي الجينومي. لمزيد من المعلومات، راجع "اعتبارات الإذابة والتخزين" في دليل المنتج. س: ما هو حجم الحمض النووي الجينومي الذي يمكن تنقيته باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin؟ ج: بافتراض استخدام مادة إدخال عالية الجودة، يتراوح حجم ذروة الحمض النووي الجينومي المعزول بهذه المجموعة بين 50 و60 كيلوبايت. الحمض النووي النموذجي يبلغ رقم ​​سلامة الحمض النووي الجينومي (DIN) المعزول من الدم أو الخلايا أو الأنسجة حوالي 9.0. تم تحسين بروتوكول تنقية الحمض النووي الجينومي Monarch لعزل الحمض النووي الجينومي الأكبر حجمًا من ذلك المعزول بواسطة مجموعات تجارية أخرى. على سبيل المثال، يتضمن البروتوكول عملية الإذابة باستخدام محلول منظم مُسخن مسبقًا، مما يُحسّن من استخلاص قطع الحمض النووي الأكبر حجمًا. مع ذلك، تحتوي بعض المواد الأولية، مثل مسحات الخد أو اللعاب، على نسبة كبيرة من الخلايا الميتة. في هذه الخلايا، تُفعّل آليات الاستماتة النيوكليازات التي تهضم الحمض النووي الجينومي إلى أجزاء أقصر. يتراوح حجم ذروة الحمض النووي الجينومي المعزول من هذه العينات عادةً بين 20 و40 كيلوبايت. س: ما هي أقل كمية مُدخلة يُمكن استخدامها مع مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin؟ ج: كميات المواد المُدخلة التي تُؤدي إلى عوائد متوقعة تبلغ حوالي 100 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي تُعادل: 5 ميكرولتر من الدم الكامل، أو 1 × 10⁴ خلية مُستزرعة، أو 0.2 ملليغرام من الأنسجة. إذا كانت كمية أقل من عند استخدام كمية قليلة جدًا من المادة الأولية، سيؤدي الارتباط غير النوعي بالأسطح إلى انخفاض معدل الاستخلاص. وللحصول على أفضل النتائج مع كميات صغيرة جدًا من المادة الأولية، يُنصح باستخدام الحمض النووي الريبوزي الحامل. راجع دليل المنتج لمزيد من التفاصيل. س: هل يمكنني استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin لتنظيف الحمض النووي الجينومي المستخلص باستخدام الفينول/الكلوروفورم؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin لتنظيف الحمض النووي الجينومي المنقى بالفينول/الكلوروفورم باتباع بروتوكول تنظيف الحمض النووي الجينومي. ومع ذلك، قد يكون الاستخلاص أقل من النسبة المعتادة البالغة 80% لأن الحمض النووي المنقى بالفينول/الكلوروفورم ينتج عادةً شظايا أطول. على الرغم من أن استخدام محلول الإذابة المسخن مسبقًا في بروتوكول Monarch يُسهل إذابة شظايا الحمض النووي الجينومي الكبيرة، إلا أن جزء الحمض النووي الجينومي الذي يزيد طوله عن 80 كيلوبايت سيتم إذابته بكفاءة أقل من مصفوفة السيليكا. س: هل يمكنني استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin لتنظيف الحمض النووي الجينومي؟ ج: نعم، Monarch يمكن استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي لتنقية الحمض النووي الجينومي من التفاعلات الإنزيمية أو بروتوكولات التنقية السابقة باتباع بروتوكول تنقية الحمض النووي الجينومي. يمكن إجراء التنقية إما مباشرةً على الحمض النووي الجينومي أو مع خطوة تعطيل إنزيمية مسبقة باستخدام بروتينيز K. من المتوقع استرداد حوالي 80% من الحمض النووي الجينومي بخطوة استخلاص واحدة عندما تكون كمية المدخلات أكبر من 100 نانوغرام. مع ذلك، إذا كان طول الحمض النووي المدخل أكبر من 80 كيلوبايت، وهو ما قد يحدث مع الحمض النووي الجينومي الذي تم تنقيته باتباع بروتوكولات مثل الفينول-الكلوروفورم أو الترسيب الملحي، فقد تكون كفاءة الاستخلاص أقل لأن الحمض النووي الجينومي الذي يزيد طوله عن 80 كيلوبايت لا يُستخلص بكفاءة من مصفوفة السيليكا. س: كيف يمكنني تقييم سلامة ونقاء الحمض النووي الجينومي؟ ج: يتم تقييم نقاء عينات الحمض النووي الجينومي المستخلص من خلال مراجعة نسب الامتصاص الضوئي التي تم جمعها أثناء قياس الطيف الضوئي الروتيني. عادةً ما يكون للحمض النووي الجينومي النقي نسبة امتصاص ضوئي عند 260/280 نانومتر تتراوح بين 1.8 و1.9. نسبة الامتصاص عند 260/230 تتراوح بين 1.8 و2.5. يتم تقييم سلامة الحمض النووي الجينومي (gDNA) بتحميل حوالي 100 نانوغرام لكل عينة على هلام أجاروز بنسبة 0.75% ومقارنة توزيع الحجم بعلامة مناسبة، مثل الحمض النووي لامدا، إما كحمض نووي كامل الطول (NEB #N3011) أو مهضوم بإنزيم HindIII (NEB #N3012). عادةً، بالنسبة للحمض النووي الجينومي السليم، يكون الجزء الأكبر من إشارة الحمض النووي الجينومي أكبر من الشريط العلوي لهضم HindIII. بدلاً من ذلك، يمكن تشغيل عينات الحمض النووي الجينومي على جهاز Agilent TapeStation® باستخدام شريط Genomic DNA ScreenTape. يوفر هذا النظام معلومات حول حجم ذروة الحمض النووي الجينومي وسلامته العامة عبر رقم سلامة الحمض النووي (DIN). تشير أحجام الذروة الكبيرة (>50 كيلوبايت) وقيم DIN التي تزيد عن 8.5 إلى أن الحمض النووي ذو جودة عالية. لمزيد من المعلومات حول تقييم نقاء الأحماض النووية، حمّل مذكرة التطبيق الخاصة بنا، "دليل عملي لتحليل الأحماض النووية". التركيز والنقاء باستخدام أجهزة قياس الطيف الضوئي ذات الحجم الميكروي. س: هل يمكنني استخدام إنزيم RNase A مختلف مع مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin؟ ج: طالما أن إنزيم RNase A له مواصفات تركيز ونشاط مماثلة، فلا بأس باستخدامه. مع ذلك، لا تتمتع العديد من منتجات RNase A بنفس مواصفات الجودة لإنزيم Monarch RNase A، الذي لا يحتوي على أي نشاط نوكلياز داخلي أو خارجي أو DNase أو بروتياز قابل للكشف، وهو خالٍ من الحمض النووي. قد تكون هذه المواصفات مهمة لتطبيقاتك اللاحقة. س: هل يمكنني استخدام بروتينيز K مختلف مع مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي Monarch®؟ ج: طالما أن بروتينيز K له مواصفات تركيز ونشاط مماثلة، فلا بأس باستخدامه. يتوفر بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية (NEB #P8107)، للشراء بشكل منفصل، ويمكن استخدامه كبديل مباشر لـ (NEB #P8200) في جميع بروتوكولات Monarch دون أي تعديلات. مع ذلك، لا تتمتع العديد من منتجات بروتينيز K الأخرى بنفس المواصفات. منتجات بروتينيز K من NEB (NEB #P8200 أو #P8107)، والتي تم توصيفها بدقة عالية لضمان أداء أكثر اتساقًا. بالإضافة إلى ذلك، لا يحتوي بروتينيز K من NEB على أي نشاط نوكلياز داخلي أو خارجي أو ديوكسي ريبونيوكلياز قابل للكشف، وهو خالٍ من الحمض النووي. قد تكون هذه المواصفات مهمة لتطبيقاتك اللاحقة. س: هل يمكنني حذف خطوة الطرد المركزي للربط بسرعة منخفضة لتوفير الوقت؟ ج: يمكنك حذف هذه الخطوة إذا رغبت، وستظل تحصل على نتائج جيدة. ومع ذلك، ستكون النتائج غير متسقة، واعتمادًا على المادة الأولية، قد تنخفض الكمية بنسبة 5-30%. يُعد الربط بسرعة منخفضة مهمًا بشكل خاص للاستخلاص الأمثل عند معالجة عينات الأنسجة التي تحتوي على كميات كبيرة من الحمض النووي وعند تنفيذ بروتوكول تنظيف الحمض النووي الجينومي. س: هل يمكنني حذف خطوة هضم RNase A من البروتوكول؟ ج: نعم، تم تصميم إجراء تنقية الحمض النووي الجينومي Monarch لتقليل كمية الحمض النووي الريبي (RNA) التي يتم تنقيتها بشكل مشترك. النسب المئوية النموذجية للحمض النووي الريبي الموجودة في مستخلصات الحمض النووي الجينومي Monarch موضحة أدناه. عند حذف خطوة هضم RNase A، تكون نسبة الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلص مع الحمض النووي الجينومي (gDNA) 1% (بروتوكول الدم)، و10% (بروتوكول الخلايا)، و1-5% (بروتوكول الأنسجة). هذه الكميات المنخفضة لا تؤثر عادةً على معظم التطبيقات اللاحقة. أما إذا تم تضمين خطوة هضم RNase A في كل بروتوكول، فإن كميات الحمض النووي الريبوزي (RNA) النهائية التي يتم تنقيتها مع الحمض النووي الجينومي (gDNA) تكون 0-1%، وهي كميات لا يمكن الكشف عنها بمعظم الطرق. س: كيف يُنصح بتخزين عينات الحمض النووي الجينومي (gDNA) المنقى؟ ج: يمكن تخزين عينات الحمض النووي الجينومي (gDNA) المنقى عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. ومع ذلك، نوصي بتخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. توفر مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي (gDNA) من Monarch® Spin (10 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 9.0، 0.1 ملي مولار EDTA) المرفقة مع مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي (gDNA) من Monarch مزيدًا من الأمان للتخزين طويل الأمد لعينات الحمض النووي الجينومي (gDNA). س: هل الحمض النووي الجينومي (gDNA) المنقى بواسطة Monarch مناسب لتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى (PCR)؟ ج: نعم. حجم القطع الكبير للحمض النووي الجينومي (gDNA) المنقى بواسطة Monarch مناسب لتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى (PCR) يُعدّ الحمض النووي الجينومي (gDNA) مادةً أوليةً ممتازةً لتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى (PCR). لتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى، نوصي باستخدام إنزيم LongAmp TaqDNA Polymerase (NEB #M0323)، أو مزيج LongAmp Taq 2x Master Mix (NEB #M0287)، أو إنزيم LongAmp Hot Start Taq Polymerase (NEB #M0534). يتميز الحمض النووي الجينومي المُنقّى باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin gDNA Extraction Kits بجودته العالية وملاءمته للتطبيقات الحساسة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). أُجريت تفاعلات التضخيم باستخدام أزواج من البادئات المُخصصة لتضخيم أجزاء من الحمض النووي البشري بأطوال 6، 8، 10، 12، 16، و20 كيلوبايت. استُخدم مزيج LongAmp® Hot Start Taq 2x Master Mix (NEB #M0533)، وأُضيف 25 نانوغرام من الحمض النووي القالب إلى كل عينة. أُجريت تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جهاز Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler. تمت مقارنة الحمض النووي الجينومي المُنقّى باستخدام Monarch والمُستخلص من خلايا HeLa والدم البشري. تمت مقارنة الحمض النووي المرجعي المتوفر تجاريًا من خط الخلايا البشرية NA19240 F11. تم تحميل 10 من أصل 20 ميكرولتر على هلام أجاروز بنسبة 1.5%، باستخدام سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت (NEB #N3232) كعلامة. أشارت النتائج إلى أن الحمض النووي كان عالي النقاء ومناسبًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى. ب. تم تخفيف الحمض النووي الجينومي المنقى بواسطة Monarch من دم بشري كامل وخلايا HeLa وذيل فأر لإنتاج نطاق خمسة لوغاريتمات من تركيزات قالب الإدخال. تم الحصول على النتائج باستخدام بادئات تستهدف gHEME (دم بشري كامل) وgREL (خلايا HeLa، ذيل فأر) لفحوصات qPCR مع مزيج Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) وتم تدويرها على جهاز Bio-Rad® CFX Touch qPCR الحراري. أشارت النتائج إلى أن الحمض النووي عالي النقاء وخالٍ من المثبطات، وهو مثالي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. س: هل يمكنني شراء محاليل وأعمدة Monarch® بشكل منفصل؟ ج: أعمدة الطرد المركزي Monarch والعديد من أعمدة Monarch تُقدم المحاليل المنظمة والكواشف بشكل منفصل. س: عند استخدام مجموعات أخرى تجارية تعتمد على أعمدة السيليكا، ألاحظ أحيانًا وجود راسب أبيض في المُستخلص. ما هذا؟ ج: تُطلق بعض مصفوفات السيليكا ألياف السيليكا أثناء عملية الاستخلاص. على الرغم من أن ألياف السيليكا لا تؤثر عمومًا على معظم التطبيقات اللاحقة، إلا أنها تؤثر على قياسات الامتصاص الضوئي، ويجب إزالتها بالطرد المركزي إذا لزم الحصول على قيم طيفية ضوئية موثوقة. تحتوي أعمدة تنقية الحمض النووي الجينومي من مونارك على غشاء مانع يمنع ألياف السيليكا من المرور، مما يُغني عن الحاجة إلى إجراء طرد مركزي إضافي قبل التحليل الطيفي الضوئي الدقيق. س: هل يُمكنني استخدام إنزيم RNase A من مونارك في تطبيقات/سير عمل أخرى غير تنقية الحمض النووي الجينومي؟ ج: على الرغم من أن شركة NEB لم تُؤكد استخدام إنزيم RNase A من مونارك في تطبيقات خارج نطاق تنقية الحمض النووي الجينومي، إلا أن الإنزيم يُفترض أن يعمل بكفاءة في التطبيقات الأخرى التي تستخدم إنزيم RNase A. س: هل الحمض النووي الجينومي المُنقّى بواسطة مونارك متوافق مع تقنية التسلسل من الجيل التالي؟ هل يمكن استخدام منصات التسلسل من الجيل التالي (NGS) مثل PacBio و Nanopore؟ ج: نعم. يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي (gDNA) المُنقّى بهذه المجموعة في تطبيقات متنوعة على منصات التسلسل هذه. بافتراض استخدام مادة إدخال عالية الجودة، يمكن الحصول على أطوال قراءة تصل إلى 50 كيلوبايت بشكل روتيني باستخدام الحمض النووي الجينومي المُنقّى بتقنية Monarch من مواد أولية مختلفة. جودة الحمض النووي المُنقّى بتقنية Monarch أفضل من جودة الحمض النووي المُنقّى بإنزيم SDS Proteinase K، والذي يُستخدم عادةً في تسلسل Nanopore. تم استخلاص 2 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام تقنية Monarch أو باتباع بروتوكول SDS Proteinase K التقليدي باستخدام الإيزوبروبانول، ثم تم تفتيته إنزيميًا مع فترات حضانة متطابقة، واستُخدم كحمض نووي مُدخل لإعداد مكتبة MinION. تم اتباع بروتوكول مجموعة Oxford Nanopore Technology أحادية البعد لإعداد المكتبات. تم تشغيل كلتا المكتبتين على جهاز MinION، وجُمعت البيانات لمدة 48 ساعة، وتم تحديد القواعد باستخدام برنامج Albacore. أظهر الحمض النووي المُنقّى بتقنية Monarch أداءً أفضل في جميع مقاييس التسلسل، بما في ذلك طول القراءة وجودتها وإجمالي بيانات التسلسل. تم جمع البيانات. توضح الرسوم البيانية أن البيانات المنقاة باستخدام تقنية Monarch توفر نسبة أعلى من بيانات التسلسل عالية الجودة مقارنةً بالحمض النووي المنقى باستخدام بروتينيز SDS K. توفر تقنية Monarch مادة أولية ممتازة الجودة لتسلسل Pacific Biosciences (PacBio). تم عزل الحمض النووي الجينومي البكتيري من 5 × 10⁹ خلية من بكتيريا الإشريكية القولونية ER2683 الحاملة للبلازميد pACYC184 باتباع بروتوكول Monarch السريع للبكتيريا سالبة الجرام. تم تقطيع 10 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي المنقى باستخدام تقنية Monarch بواسطة أنبوب Covaris® g-TUBE، بهدف الوصول إلى حجم شظايا 10 كيلوبايت. تم استخدام 5 ميكروغرام من الحمض النووي المقطّع لإعداد المكتبة وفقًا لبروتوكول PacBio القياسي (بدون اختيار الحجم). تم تسلسل العينات على جهاز تسلسل Pacific Biosciences RSII، باستخدام كيمياء P6/C4، وتم تحميلها كمكتبة SMRTbell بتركيز 10 بيكومولار، وتم جمع البيانات في فيلم مدته 5 ساعات. إجمالي القواعد (الناتج): 1208 ميجابايت. متوسط ​​طول قراءة البوليميراز: 16046، جودة قراءة البوليميراز: 0.85. متوسط ​​قراءات طول الإدخال: 6060، جودة قراءات الإدخال: 0.89، أطول قراءة للإدخال: 43680. أ. تشير أطوال الإدخال إلى أن غالبية القراءات كانت ضمن نطاق حجم الإدخال المطلوب. ب. تشير أطوال قراءة البوليميراز إلى أن الحمض النووي المنقى كان عالي الجودة، مما سمح للإنزيم بقراءة الإدخال عدة مرات ضمن بنية SMRTbell. ج. توضح بيانات تقييم التحميل أيضًا أن الحمض النووي المنقى عالي الجودة. س: لماذا انفصل غشاء السيليكا على أعمدة Monarch Spin Columns S2C (NEB #T3017) أثناء تحضير الحمض النووي الجينومي؟ ج: صُممت أعمدة Monarch Spin Columns S2C بدون حلقة تثبيت لمنع التلوث الناتج عن انتقال المحلول المنظم وضمان أقصى قدر من نقاء الحمض النووي المستخلص. عند تنفيذ البروتوكول كما هو محدد، تبقى الأغشية في مكانها ولا ينبغي أن تنفصل. قد ينفصل الغشاء. مع ذلك، يمكن أن يتمدد الغشاء وينفصل في ظروف محددة للغاية: تحميل العمود أكثر من مرة، ترك العينة المحللة أو محلول الغسيل على الغشاء لفترة طويلة جدًا، استخدام جهاز الخلط الدوامي، تجاوز كميات الإدخال بشكل كبير، وقد يكون الغشاء أكثر عرضة للانفصال أثناء الدوران بسرعات منخفضة. بالنسبة للمجموعات التي تحتوي على أعمدة Monarch Spin Columns S2C ذات اللون البرتقالي (NEB #T3017)، اتبع البروتوكولات الحالية التي لا تستخدم الدوران بسرعة منخفضة (1000 × g لمدة 3 دقائق). بناءً على ذلك، نوصي باتباع البروتوكول كما هو محدد وعدم إعادة تحميل العمود أو استخدامه مع جهاز الخلط الدوامي. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010) لعزل الحمض النووي الجينومي من ذبابة الفاكهة والحشرات الأخرى؟ ج: نعم، ونوصي باتباع البروتوكول المفصل لتنقية الحمض النووي الجينومي من الحشرات. هذه نسخة معدلة من بروتوكول تنقية الحمض النووي الجينومي من الأنسجة، مُحسَّنة لمعالجة عينات الحشرات. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010) لعزل الحمض النووي الجينومي من النباتات؟ ج: على الرغم من أنها ليست مُحسَّنة خصيصًا لهذا التطبيق، فقد حقق العديد من المستخدمين نجاحًا في معالجة عينات نباتية (القنب، أوراق القمح، أوراق الأوركيد) باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin. ومع ذلك، تحتوي العينات النباتية على عديدات سكاريد معقدة وبوليفينولات، لم يتم تحسين نظام محلول Monarch للتعامل معها. نوصي باتباع بروتوكول الأنسجة. قبل التحلل باستخدام محلول تحلل الأنسجة، يجب فتح جدران الخلايا النباتية قدر الإمكان إما باستخدام مدقة أنبوب دقيق، أو الطحن تحت النيتروجين السائل، أو باستخدام مطحنة خرز. بعد التحلل وحضانة RNase A، قم بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق بأقصى سرعة (≥12000 × g) لإزالة المواد الصلبة ونقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. نوصي باستخدام أقل من 25 ملغ من المادة الأولية، كما يُوصى باستخدام أنسجة صغيرة للحصول على أفضل النتائج. تختلف كمية الحمض النووي المستخلص بشكل كبير بين أنواع النباتات المختلفة بناءً على حجم جينومها وسهولة الوصول إلى الحمض النووي. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010) لعزل الحمض النووي الجينومي من البلازما والمصل والبول؟ ج: لا نوصي باستخدام هذه المجموعة لعزل الحمض النووي الجينومي من البلازما أو المصل أو البول. لم يتم التحقق من صحة هذه المجموعة على هذه الأنواع من العينات، وهي غير مُحسَّنة لمعالجة كميات كبيرة من المواد الأولية. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010) لعزل الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA)؟ ج: لا نوصي باستخدام هذه المجموعة لعزل الحمض النووي الخالي من الخلايا. يحتوي الحمض النووي الخالي من الخلايا على شظايا صغيرة من الحمض النووي، والكيمياء الرابطة في هذه المجموعة غير مُحسَّنة للشظايا الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن سير العمل غير مُحسَّن لمعالجة كميات كبيرة من المواد الأولية، وهو أمر ضروري غالبًا عند عزل الحمض النووي الخالي من الخلايا. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB س: هل يمكن استخدام المجموعة (#T3010) مع مشعب تفريغ؟ ج: نعم، يمكن استخدام المجموعة مع مشعب تفريغ لخطوة الربط والغسل الأولى من الجزء الثاني: ربط الحمض النووي الجينومي وإذابته. يجب إجراء خطوة الغسل الثانية والإذابة في جهاز طرد مركزي. قد تنخفض نقاوة العينات المنقاة بالتفريغ، حيث يمكن أن تبقى البروتينات ومكونات خلوية أخرى على الغشاء؛ يُوصى بالطرد المركزي عالي السرعة للحصول على أقصى قدر من النقاوة وقابلية التكرار. س: لم يتم تخزين الإنزيمات الموجودة في المجموعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية على الفور. هل ستظل فعالة؟ ج: نعم، إنزيمات مونارك بروتينيز K وRNAse A غير المفتوحة مستقرة في درجات الحرارة المحيطة لفترة قصيرة. بعد الفتح، يجب تخزين بروتينيز K وRNAse A من مونارك عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: هل يهم نوع مضاد التخثر المستخدم في عينات الدم؟ ج: لا، عزل الحمض النووي الجينومي من الدم باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin يعمل بشكل جيد مع الدم المعالج إما بـ EDTA أو السترات أو الهيبارين. س: يوجد راسب في أنبوب إنزيم البروتينيز K، هل هذا طبيعي؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض غير متبلور في أنبوب البروتينيز K. لا يؤثر ذلك على نشاط البروتينيز K أو وظيفة المجموعة، لذا يمكنك المتابعة كالمعتاد. س: لاحظت أنني أضغط على العمود لإدخاله في أنبوب التجميع. هل هذا طبيعي؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: يتم توفير أنابيب تجميع مناسبة في جميع مجموعات Monarch® لأعمدة الدوران. إذا كنت تستخدم أنابيب تجميع من خارج المجموعة، فيُرجى استخدام أنابيب تجميع Monarch® Spin (NEB #T2118). تجنب إدخال أي أعمدة في أنابيب تجميع غير موصى بها ذات مقاس ضيق جدًا لتجنب تلف العمود. س: لاحظتُ أن أعمدة Monarch Spin S2C (NEB #T3017) المستخدمة لتنقية الحمض النووي الجينومي في مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch® Spin (NEB #T3010) أصبحت ملونة باللون البرتقالي. هل يؤثر ذلك على الأداء؟ ج: لا يؤثر اللون على الأداء. اتبع إرشادات الاستخدام الموصى بها، بما في ذلك إرشادات الحد الأقصى للإدخال في الدليل. خزّن الأعمدة الملونة بعيدًا عن الضوء لتجنب بهتان اللون مع مرور الوقت. قد توجد اختلافات طبيعية في درجة اللون بين الأعمدة. س: لماذا تم حذف خطوة الطرد المركزي البطيء (1000 × g لمدة 3 دقائق) من بروتوكولات مجموعة استخلاص الحمض النووي الجينومي Monarch Spin (NEB #T3010)؟ هل ما زال بإمكاني إجراء هذه الخطوة؟ ج: يهدف تغيير البروتوكول لإزالة خطوة الطرد المركزي البطيء (1000 × g لمدة 3 دقائق) في خطوة الربط إلى تبسيط سير العمل وتوفير الوقت. وقد أظهرت اختباراتنا عدم وجود أي تأثير على الأداء أو الإنتاجية. يُنصح مستخدمو مجموعات أعمدة مونارك سبين S2C (NEB #T3017) ذات اللون البرتقالي باتباع البروتوكولات المُحدَّثة لتحسين الكفاءة. س: لقد استخدمتُ كل بروتينيز K (NEB #P8200) المُضمَّن في مجموعة مونارك. هل يُمكنني شراء المزيد؟ ج: نعم، بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية (NEB #P8107)، مُتاح للشراء بشكل مُنفصل، ويُمكن استخدامه كبديل مُباشر لـ (NEB #P8200) في جميع بروتوكولات مونارك دون أي تعديلات. س: أرى بعض بقايا السيليكا في عمود مونارك الخاص بي. هل هذه مُشكلة؟ ج: لا، هذه ليست مُشكلة. إن وجود بعض بقايا أو جزيئات السيليكا في عمود تنقية الأحماض النووية لا يُؤثر على ارتباط الأحماض النووية أو نقائها. صُمِّمت أعمدتنا للاحتفاظ بألياف السيليكا، مما يُساعد على ضمان عدم وصولها إلى المُستخلص النهائي.