مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الخلايا والدم من شركة نيو إنجلاند بيولابس، طراز T3050S، مونارك®

الفئات ذات الصلة: استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، تنقية الأحماض النووية. الأسئلة الشائعة : س: كيف يؤثر البروتين المتبقي الزائد في عينات الدم والأنسجة على عملية التنقية؟ ج: إذا وُجد بروتين زائد في المحلول قبل إضافة الإيزوبروبانول لخطوة الترسيب، فإن هذا البروتين الملوث يمنع ارتباط الحمض النووي بالخرز بشكل صحيح. يتسبب البروتين الزائد في المحلول في طفوه داخله، مما يمنعه من الارتباط بالخرز بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، تميل الخرزات الزجاجية إلى الالتصاق في قاع الأنابيب سعة 2 مل. لذلك، من المهم جدًا إزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي المحتوي على الهيموجلوبين من كريات الدم الحمراء أثناء تحضير الدم؛ لا تترك أكثر من 20 ميكرولتر. وينطبق الأمر نفسه على تحضير الأنسجة؛ فتجاوز الحد الأقصى لكميات الإدخال سيؤدي أيضًا إلى زيادة البروتين في المحلول، ولن يرتبط الحمض النووي بالخرز بكفاءة. س: ما هو نظام القياس الأنسب لتقييم تركيز الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA)؟ ج: بحسب خبرتنا، وخلافًا للاعتقاد السائد، فإن قياس تركيز الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي باستخدام جهاز Qubit® ليس الطريقة الأكثر دقة. توفر قياسات الامتصاص الضوئي (OD) قيم تركيز أكثر دقة، ولكن نظرًا للزوجة العالية لعينات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، يلزم إجراء عدة تكرارات. عادةً ما تقلل قراءات Qubit من تقدير كمية الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي؛ فبالنسبة للحمض النووي الجينومي المعزول باستخدام أعمدة الغزل السيليكا (عادةً 20-80 كيلوبايت)، يوفر Qubit قراءات تركيز الحمض النووي أقل بنسبة 10-15% من تلك التي يتم الحصول عليها بواسطة مطياف ضوئي. تقل قدرة الصبغة المتداخلة على تلوين الحمض النووي مع زيادة طول قطعة الحمض النووي، مما يؤدي إلى فرق أكبر بين قيم Qubit وقيم الامتصاص الضوئي عند العمل مع الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي. قد تصل الفروق إلى 35%، أو حتى أعلى في بعض الحالات، مما يؤدي إلى تقليل كبير في تقدير تركيز الحمض النووي. س: أسقطتُ بعضًا من خرزاتي الزجاجية. هل يمكنني تنظيفها، وهل توفرون خرزات إضافية؟ ج: توفر شركة NEB كمية إضافية من الخرز تحسبًا لفقدان بعضها. في مجموعات التحضير الخماسية، نوفر خرزتين إضافيتين، وفي مجموعات التحضير الخمسينية، نوفر ما بين 5 إلى 7 خرزات إضافية. كما تتوفر خرزات Monarch DNA Capture للشراء بشكل منفصل (NEB #T3005). بالإضافة إلى ذلك، يمكن غسل أي خرزات مفقودة بمحلول منظف (مثل 2% SDS أو RNaseZap)، ثم شطفها بالماء والإيثانول بتركيز 70%، وتجفيفها قبل استخدامها. س: هل هناك أي ميزة خاصة في خرزات Monarch DNA Capture، أم يمكنني استخدام أي خرز زجاجي؟ ج: خرزات Monarch DNA Capture هي خرزات زجاجية متخصصة من البوروسيليكات، مُحسَّنة لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) في عملية استخلاص Monarch. على الرغم من أن أنواعًا أخرى من الخرز الزجاجي قد تُنقي الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بنجاح، إلا أن خرزات Monarch Capture تُوفر أداءً مثاليًا في التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل Nanopore. لا يمكننا ضمان أداء مماثل باستخدام أي خرز زجاجي آخر غير المُرفق. س: هل تتوافق مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك مع العينات المخزنة في محلول حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك، أو محلول RNAlater، أو محلول DNA/RNA Shield، وما إلى ذلك؟ ج: نعم. بالنسبة لمحلول RNAlater®، يكفي إزالة محلول التثبيت تمامًا قبل المعالجة. بعد ذلك، يمكن اتباع البروتوكولات القياسية. عند استخدام محلول حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك (NEB #T2011) أو محلول DNA/RNA Shield® من زيمو، يجب استخدام المحلول بتخفيف 1X للتحليل، بدلاً من محلول التحليل المرفق في المجموعة. عمومًا، تكون النتائج المُتحصل عليها من المواد الطازجة والمجمدة أفضل من العينات المُثبتة من حيث الكمية والنقاء وطول القطع. س: كيف أعرف أن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي قد التصق بالخرز الزجاجي في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك؟ ج: عندما تحتوي العينات على أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وهو أمر شائع عند العمل بكميات "المدخلات القياسية"، يكون ارتباط الحمض النووي بالخرز مرئيًا، ويظهر على شكل طبقة ضبابية معتمة تغطي الخرز. ستلتصق الخرز ببعضها دائمًا بعد ارتباط هذه الكمية من الحمض النووي بها. عند إجراء عمليات الانقلاب يدويًا باستخدام كميات "المدخلات القياسية"، يمكن رؤية عملية الارتباط ومتابعتها. بعد 5 عمليات انقلاب، يصبح الحمض النووي الضبابي مرئيًا، وفي عمليات الانقلاب العشر التالية، يرتبط بالخرز ويبدأ بالالتفاف حولها. في هذه المرحلة، يبقى المحلول لزجًا. بمجرد أن يلتف الحمض النووي تمامًا حول الخرز خلال عمليات الانقلاب المتبقية (10-15 عملية)، يفقد المحلول لزوجته. عادةً ما تنتج عينات "المدخلات المنخفضة" ما بين 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وقد يكون من الصعب متابعة ارتباط الحمض النووي. إذا كانت كمية الحمض النووي تتراوح بين 1 و5 ميكروغرامات فقط، فمن غير المرجح أن يكون من الممكن رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز؛ إذ سيبدو أن الخرز يتحرك بحرية وبشكل مستقل في المحلول. أما عند وجود كمية تتراوح بين 5 و10 ميكروغرامات من الحمض النووي، فمن الصعب رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز، ولكن الحمض النووي المرتبط غالبًا ما يتسبب في التصاق الخرز ببعضه. س: هل هناك أي فائدة من إضافة عملية اختيار الحجم (مثل Circulomics® Short Read Eliminator) بعد الاستخلاص؟ ج: بحسب خبرة NEB، فإن خطوة اختيار الحجم ليست ضرورية عادةً قبل تسلسل النانوبور القائم على الربط. عند العمل بمواد أولية طازجة وعالية الجودة، تكون أطوال قراءة N50 عالية (35-55 كيلوبايت، حسب العينة)، ولن يوفر اختيار حجم إضافي للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي سوى تحسن طفيف في طول القراءة. مع ذلك، عند العمل بمواد أولية ذات جودة منخفضة، مثل تلك التي تم تخزينها بشكل غير مثالي، أو عند العمل بعينات يصعب تحليلها (مثل ذيل الفأر)، سيحتوي الحمض النووي الناتج على نسبة أكبر من الشظايا القصيرة. في هذه الحالات، قد يكون من المفيد إجراء خطوة إثراء لتحسين نتائج التسلسل؛ ويمكن استخدام أي منتج لاختيار الحجم (مثل مُزيل القراءات القصيرة) مع الحمض النووي المعزول باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك. س: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك إذا لم يكن لديّ خلاط حراري؟ ج: إذا كان الهدف هو الحصول على حمض نووي بأقصى حجم، فلا يلزم الرج أثناء التحليل في الخلاط الحراري. مع ذلك، يجب إجراء هضم البروتينيز K عند 56 درجة مئوية. لضمان التحليل السليم، اقلب عينتك عدة مرات ببطء أثناء حضانة البروتينيز K. يُرجى ملاحظة أن العينات التي تم تحليلها بدون تحريك ستكون لزجة للغاية ويصعب التعامل معها. إذا كان الهدف هو ضبط حجم الحمض النووي (DNA) إلى 50-250 كيلوبايت (وهو الحجم الأمثل لتسلسل النانوبور القائم على الربط)، فإننا نوصي بشدة باستخدام خلاط حراري (مثل Eppendorf® ThermoMixer® C). سيؤدي ذلك إلى قص متحكم به للوصول إلى نطاق حجم الشظايا الأمثل. في حال تعذر استخدام الخلاط الحراري، فإن أفضل بديل للتقليب هو استخدام جهاز الخلط الدوامي النبضي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة ممكنة بعد فترة حضانة التحلل. بالنسبة لعينات الأنسجة، قم بتقليب العينة لفترة وجيزة كل دقيقة تقريبًا خلال بداية فترة حضانة التحلل، حتى تختفي جميع قطع الأنسجة. ثم قم بالتقليب مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة بعد انتهاء فترة حضانة التحلل. سؤال: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW) من Monarch لمعالجة عينات نباتية؟ جواب: لا نوصي باستخدام هذه المجموعة لاستخلاص الحمض النووي من النباتات. لا تتم إزالة السكريات المتعددة الموجودة في مستخلصات النباتات بشكل فعال باستخدام محلول تحلل أنسجة الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي المرفق، وهو المحلول الموجود في مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الأنسجة (NEB #T3060). يمنع وجود السكريات المتعددة المتبقية ارتباط الحمض النووي بالخرز الزجاجي. إذا كان لديك نظام تحلل خاص بك يمكن استخدامه مع طريقة عملنا، فنحن نشجعك بشدة على تجربته. أبرزت دراستنا الأولية أهمية البدء بما لا يقل عن 50 ملغ من أنسجة النبات، لأن كفاءة الارتباط بالخرز الزجاجي تتطلب كتلة حرجة من الحمض النووي. استخدام كميات أقل من الحمض النووي لن يوفر كمية كافية منه للسماح بارتباطه بالخرز. في حال تحضير نوى من عينات نباتية، يُرجى اختيار مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة نوى النبات (لم تُصدق NEB على هذه الطريقة، ولكنها ترحب بتجربتها). إذا كانت نوى الخلايا النباتية موجودة في محلول منظم مخصص، فاستخدم هذا المحلول بدلاً من محلول تحضير النوى. أو يمكنك ترسيب النوى وإعادة تعليقها في محلول تحضير النوى، ثم اتباع البروتوكول من هناك. نشجعك على مشاركة ملاحظاتك حول اختبار تقنيتنا على عينات نباتية عبر مراسلتنا على البريد الإلكتروني info@neb.com. سؤال: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الحشرات؟ جواب: لقد نجحنا في عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من بعوضة الزاعجة المصرية (15 ملغ) باستخدام بروتوكول الأنسجة القياسي. مع أننا لم نتحقق داخليًا من صحة النتائج مع أي حشرات أخرى حتى الآن، فقد نجح آخرون في معالجة الذباب والعث والمفصليات (العقارب) وبعض الديدان الأسطوانية. قد تكون الاعتبارات التالية مفيدة: استخدم عينات طازجة إن أمكن؛ قد يؤدي التجميد والذوبان إلى تنشيط نشاط النيوكلياز. عند التعامل مع الحشرات الكبيرة، نوصي بإزالة محتويات الأمعاء (الغنية بالنيوكلياز) قبل التجنيس. يُعد التجنيس الجيد باستخدام المدقة أو جهاز التجنيس الدوار الثابت ضروريًا، ومن المهم إضافة محلول التحلل (الذي يزيل النيوكلياز) بسرعة بعد التجنيس. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الخميرة و/أو الفطريات؟ ج: لقد تحققنا من صحة مجموعتنا لمعالجة عينات الخميرة، ونشرنا بروتوكولًا يعتمد على العمل مع عينات خميرة الخباز (S. cerevisiae). لم نختبر المجموعة داخليًا على الفطريات الخيطية. مع ذلك، استنادًا إلى عملنا في تطوير مجموعة السيليكا الخاصة بنا (NEB #T3010)، والتي تستخدم كيمياء تحلل مماثلة، وجدنا أن تركيبتنا الكيميائية قد تكون فعالة مع بعض الفطريات عند تجميد العينة في النيتروجين السائل وطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام المدقة والهاون. بالنسبة للفطر، يجب استخدام مادة أولية مجففة. مع ذلك، ستحتاج هذه الطريقة إلى اختبارها على نوع الفطر المحدد. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة طبقة الكريات البيضاء البشرية؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة طبقة الكريات البيضاء. عند التعامل مع طبقة الكريات البيضاء، وهي محلول مركز من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، يجب استخدام كميات أقل من تلك المستخدمة عند التعامل مع الدم. يجب ألا يتجاوز العدد الإجمالي للخلايا 1 × 10⁷ خلية في البروتوكول القياسي (التحريك بسرعة 2000 دورة في الدقيقة)، ولا يتجاوز 5 × 10⁶ خلية عند الحاجة إلى الحمض النووي فائق الوزن الجزيئي (تحريك خفيف). تحتوي طبقة الكريات البيضاء، كما يتم الحصول عليها من بنوك الدم، على ما يصل إلى 1 × 10⁹ خلية ليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي لكل 30-80 مل، وهو ما يعادل تقريبًا 1 × 10⁷ إلى 3 × 10⁷ خلية/مل. نقترح البدء بـ 100-300 ميكرولتر من هذا المحلول، وإضافة محلول الفوسفات الملحي (PBS) حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر، ثم الانتقال إلى إجراء تحليل كريات الدم الحمراء كما لو كانت عينة دم بحجم 500 ميكرولتر. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من مونارك لمعالجة عينات غسول الفم؟ ج: لم نختبر ذلك، ولكن نتوقع أن تعمل مع مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050). يتكون تجمع الخلايا في عينة غسول الفم عادةً من خلايا ظهارية فموية وخلايا دم بيضاء. يمكن ترسيب هذه الخلايا كما هو موصى به في بروتوكول الخلايا، ونوصي بغسل الراسب بمحلول الفوسفات الملحي البارد (PBS) مرة أو مرتين. من المهم وجود عدد كافٍ من الخلايا، لذا قد يتطلب الأمر حجمًا كبيرًا من المادة الأولية، لأن كثافة الخلايا (وبالتالي كمية الحمض النووي) في غسول الفم تميل إلى أن تكون منخفضة. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة العينات البيئية أو البرازية لدراسات الميتاجينوم؟ ج: لا نوصي باستخدام مجموعتنا لمعالجة العينات البيئية كالتربة أو العينات البرازية. تواجه هذه العينات تحديين رئيسيين: احتواؤها على كمية كبيرة من النيوكلياز، واحتوائها على مثبطات يصعب إزالتها (حمض الهيوميك في التربة، والأحماض الصفراوية في العينات البرازية). تؤدي كمية النيوكلياز إلى تدهور كبير في الحمض النووي، مما يجعله غير مناسب لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، كما أن المثبطات الموجودة في هذه العينات لن تُزال بفعالية باستخدام التركيب الكيميائي الحالي للمجموعة. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لعزل الحمض النووي البكتيري الاصطناعي (BAC)؟ ج: لم نختبر ذلك، لكننا نتوقع أن ينجح الأمر لأن تركيبات BAC تقع ضمن النطاق الأمثل لحجم ارتباط الخرز. مع ذلك، عادةً ما تكون تركيبات BAC ذات عدد نسخ منخفض جدًا، وسيلزم كمية كبيرة من المزرعة لتجميع كمية كافية من الحمض النووي BAC لارتباط الخرز (> 5 ميكروغرام). سيؤدي ذلك إلى زيادة أحجام المحاليل المنظمة اللازمة في عملية التحلل القلوي. إجمالاً، يجب ألا يتجاوز حجم محاليل التحلل القلوي الثلاثة 1100 ميكرولتر، وذلك لضمان ارتباط الحمض النووي بالخرز في أنبوب تفاعل سعة 2 مل. قد يتطلب الأمر بعض التحسينات، ولكن من الممكن ربط كيمياء التحلل القلوي بجزء ارتباط الخرز وتنقية الحمض النووي في بروتوكولات مونارك. س: هل لديكم أي نتائج تسلسل PacBio للحمض النووي المستخلص من عينات الأنسجة باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك؟ ج: نعم، لقد أجرينا تجارب مقارنة مع مكتبات PacBio SMRTbell المُحضّرة باستخدام الحمض النووي من الخلايا (HEK293)، والدم (الخنزير)، والبكتيريا (الإشريكية القولونية)، وعينات الأنسجة (كلية الفأر). في عمليات التشغيل المُرمّزة، كانت جميع مقاييس التسلسل متشابهة للغاية. تم تشغيل مكتبات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) المُحضّرة باستخدام تقنية Monarch، وحققت نتائج ممتازة على جهازي Sequel I وSequel II. وقد أظهر الحمض النووي أداءً جيدًا في عمليات التسلسل التقليدية وتقنية HiFi. س: هل تعمل آلية استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من Monarch مع الخلايا المفردة؟ ج: للأسف، هذه الآلية غير متوافقة مع الخلايا المفردة. يتطلب النظام وجود كتلة حرجة من الحمض النووي (≥ 1 ميكروغرام في ~100 ميكرولتر) لضمان ارتباطه الفعال بالخرز. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المستخلص باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من Monarch في تحليل ساوثرن بلوت؟ ج: نعم، يمكن استخدام الحمض النووي المستخلص في تحليل ساوثرن بلوت. تأكد من فصل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) على هلام نبضي، حيث أنه على هلام الأغاروز العادي، سيعلق الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) في فتحات الهلام. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من Monarch لمعالجة الديدان الخيطية؟ ج: نعم. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من دودة C. elegans باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الأنسجة (NEB #T3060) من شركة Monarch، وذلك باتباع البروتوكول القياسي لعينات الأنسجة (تمت معالجة الديدان من طبقين). نوصي باستخدام جهاز تجنيس دوار-ثابت لتجانس العينة للحصول على أفضل النتائج. س: عينة دمي مجمدة في أجزاء أكبر من الموصى بها في بروتوكولكم (مثلًا، في أنابيب Vacutainer). هل يمكنني استخدام بروتوكول الدم المجمد لمجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للخلايا والدم من شركة Monarch (NEB #T3050)؟ ج: نعم، ولكن من المهم عدم إذابة العينة تمامًا (أو تسخينها) عندما لا تكون في وجود محلول تحلل كريات الدم الحمراء، لأن السماح للعينة بالتسخين سيؤدي إلى تنشيط النيوكليازات بسرعة. حضّن وعاء الدم في درجة حرارة الغرفة حتى يبدأ بالذوبان (سيصبح لونه أحمر داكنًا). ضع الأنبوب في جهاز تدوير الأنابيب بسرعة 20 دورة في الدقيقة، وقم بتدويره حتى يذوب الدم تقريبًا تمامًا. راقب العينة على جهاز التدوير بعناية فائقة لتحديد اللحظة التي تكاد فيها تذوب. عندئذٍ، قم برجّ الأنبوب لفترة وجيزة لإتمام عملية الذوبان وإذابة أي تكتلات، ثم ضعه بسرعة على الثلج. خذ جزءًا من الدم لتحضيره (يوصى أن يكون حجم البداية 500 ميكرولتر) وضعه في أنبوب سعة 2 مل. أضف 3 أحجام من محلول تحلل كريات الدم الحمراء البارد، واخلطه بالتقليب 5 مرات، ثم تابع بروتوكول الدم المجمد (الخطوة 5). لا يجب إعادة تجميد عينات الدم المذابة. بدلاً من ذلك، يمكنك إذابة عينة الدم قليلاً جدًا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية، بما يكفي فقط لفصلها عن الوعاء ونقلها إلى وعاء أكبر يتسع لإضافة 3 أحجام من محلول تحلل كريات الدم الحمراء البارد. بعد ذلك، يمكن إذابة العينة في وجود محلول تحلل كريات الدم الحمراء وفقًا للبروتوكول. يُرجى ملاحظة أن هذه الطريقة قد تتطلب كمية إضافية من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (NEB #T3051L). س: أواجه صعوبة في إذابة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد عزله. هل لديكم أي نصائح لزيادة الذوبان؟ ج: من المعروف أن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) يصعب إذابته. عندما تكون عينات الحمض النووي عالية التركيز أو تحتوي على حمض نووي فائق الوزن الجزيئي، يصبح إذابته أكثر صعوبة. بشكل عام، كلما زاد انضغاط الحمض النووي، زادت صعوبة إذابته. توفر حبيبات الزجاج المستخدمة في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch سطحًا واسعًا يلتف حوله الحمض النووي، مما يحافظ عليه عادةً في شكل مفتوح، ويسهل إذابته. مع ذلك، قد يظل الذوبان يمثل مشكلة. فيما يلي بعض النصائح لزيادة ذوبان الحمض النووي (DNA) عند استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) من مونارك: حاول تقليل مدة ارتباط الحمض النووي بالخرز دون وجود سائل. بعد إزالة السائل من الخرز، أضف المحلول المنظم التالي فورًا. كلما طالت مدة جفاف الحمض النووي على الخرز، زادت كثافته وصعوبة إذابته لاحقًا. عند ربط الحمض النووي بالخرز، لا تقلب العينة لفترة أطول من الموصى بها. كلما طالت مدة التفاف الحمض النووي حول الخرز، زادت كثافته وصعوبة إذابته لاحقًا. راجع دليل الاستخدام الخاص بنا، "تجانس عينات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) بعد الاستخلاص"، لمزيد من النصائح حول تجانس الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد الاستخلاص. سؤال: لم يتم تخزين الإنزيمات الموجودة في المجموعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية مباشرةً. هل ستظل فعالة؟ جواب: نعم، إنزيمات مونارك بروتينيز K وRNAse A غير المفتوحة مستقرة في درجات الحرارة المحيطة لفترة قصيرة. بعد الفتح، يجب تخزين بروتينيز K وRNAse A من Monarch عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: يوجد راسب في أنبوب إنزيم بروتينيز K، هل هذا طبيعي؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض غير متبلور في أنبوب بروتينيز K. لا يؤثر ذلك على نشاط بروتينيز K أو وظيفة المجموعة، لذا يمكنك متابعة سير عملك كالمعتاد. س: ما هي أعمدة Monarch® وحوامل الخرز التي يمكن استخدامها مع أي أنبوب تجميع Monarch؟ ج: أنابيب تجميع Monarch الدوارة (NEB# T2118) متوافقة مع أعمدة تنقية RNA من Monarch (NEB #T2007)؛ وأعمدة إزالة gDNA من Monarch (NEB #T2017)؛ وأعمدة تنظيف RNA من Monarch (NEB #T2037، #T2047، #T2057)؛ وأعمدة تنقية gDNA من Monarch (NEB #T3017). وحلقات تثبيت خرز مونارك (NEB #T3004). أنابيب تجميع مونارك (NEB #T1018) متوافقة مع أعمدة مونارك لتحضير البلازميد المصغر (NEB #T1017)، وأعمدة مونارك لتنقية الحمض النووي (NEB #T1034). أنابيب تجميع مونارك II (NEB #T2018) متوافقة مع أعمدة مونارك لتنقية الحمض النووي الريبوزي (NEB #T2037، #T2047، #T2057) (ضمن دفعات محددة)؛ وأعمدة مونارك لتنقية الحمض النووي الجينومي (NEB #T3017) (ضمن دفعات محددة)؛ وحلقات تثبيت خرز مونارك (NEB #T3004) (ضمن دفعات محددة). س: لاحظتُ تغييراً طفيفاً في أبعاد أنبوب التجميع في مجموعة مونارك® لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للخلايا والدم (NEB #T3050) ومجموعة مونارك لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للأنسجة (NEB #T3060). هل سيؤثر هذا على الأداء؟ ج: تعمل شركة NEB على توحيد كمية البلاستيك المستخدمة في مجموعاتها لتقليل النفايات أثناء إنتاجها. ولن تؤثر التغييرات الطفيفة في الأبعاد على أداء المنتج. س: لاحظتُ أنني أبذل جهدًا لإدخال العمود في أنبوب التجميع. هل هذا صحيح؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: تُرفق أنابيب تجميع مُطابقة مع جميع مجموعات Monarch® لأعمدة الطرد المركزي. إذا كنت تستخدم أنابيب تجميع من خارج المجموعة، فيُرجى استخدام أنابيب تجميع Monarch® Spin (NEB #T2118). تجنب إدخال أي أعمدة بالقوة في أنابيب تجميع غير مُوصى بها ذات مقاس ضيق جدًا لتفادي تلف العمود. س: لقد استخدمتُ كل كمية بروتينيز K (NEB #P8200) الموجودة في مجموعة Monarch. هل يُمكنني شراء المزيد؟ ج: نعم، بروتينيز ك، درجة البيولوجيا الجزيئية (NEB #P8107)، متاح للشراء بشكل مستقل ويمكن استخدامه كبديل مباشر لـ (NEB #P8200) في جميع بروتوكولات مونارك دون أي تعديلات.