نيو إنجلاند بيولابس، T3060S، مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك® للأنسجة

الفئات ذات الصلة: استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، تنقية الأحماض النووية. الأسئلة الشائعة : س: كيف يؤثر البروتين المتبقي الزائد في عينات الدم والأنسجة على عملية التنقية؟ ج: إذا وُجد بروتين زائد في المحلول قبل إضافة الإيزوبروبانول لخطوة الترسيب، فإن هذا البروتين الملوث يمنع ارتباط الحمض النووي بالخرز بشكل صحيح. يتسبب البروتين الزائد في المحلول في طفوّ الحمض النووي المترسب داخله، مما يمنعه من الارتباط بالخرز بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، تميل الخرزات الزجاجية إلى الالتصاق في قاع الأنابيب سعة 2 مل. لذلك، من المهم جدًا إزالة أكبر قدر ممكن من السائل الطافي المحتوي على الهيموجلوبين من كريات الدم الحمراء أثناء تحضير الدم؛ لا تترك أكثر من 20 ميكرولتر. وينطبق الأمر نفسه على تحضير الأنسجة؛ فتجاوز الحد الأقصى لكميات الإدخال سيؤدي أيضًا إلى زيادة البروتين في المحلول، ولن يرتبط الحمض النووي بالخرز بكفاءة. س: ما هو نظام القياس الأنسب لتقييم تركيز الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA)؟ ج: بحسب خبرتنا، وخلافًا للاعتقاد السائد، فإن قياس تركيز الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي باستخدام جهاز Qubit® ليس الطريقة الأكثر دقة. توفر قياسات الامتصاص الضوئي (OD) قيم تركيز أكثر دقة، ولكن نظرًا للزوجة العالية لعينات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، يلزم إجراء عدة تكرارات. عادةً ما تقلل قراءات Qubit من تقدير كمية الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي؛ فبالنسبة للحمض النووي الجينومي المعزول باستخدام أعمدة الغزل السيليكا (عادةً 20-80 كيلوبايت)، يوفر Qubit قراءات تركيز الحمض النووي أقل بنسبة 10-15% من تلك التي يتم الحصول عليها بواسطة مطياف ضوئي. تقل قدرة الصبغة المتداخلة على تلوين الحمض النووي مع زيادة طول قطعة الحمض النووي، مما يؤدي إلى فرق أكبر بين قيم Qubit وقيم الامتصاص الضوئي عند العمل مع الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي. قد تصل الفروق إلى 35%، أو حتى أعلى في بعض الحالات، مما يؤدي إلى تقليل كبير في تقدير تركيز الحمض النووي. س: أسقطتُ بعضًا من خرزاتي الزجاجية. هل يمكنني تنظيفها، وهل توفرون خرزات إضافية؟ ج: توفر شركة NEB كمية إضافية من الخرز تحسبًا لفقدان بعض الخرز. في مجموعات التحضير الخماسية، نوفر خرزتين إضافيتين، وفي مجموعات التحضير الخمسينية، نوفر ما بين 5 إلى 7 خرزات إضافية. كما تتوفر خرزات Monarch DNA Capture للشراء بشكل منفصل (NEB #T3005). بالإضافة إلى ذلك، يمكن غسل أي خرزات مفقودة بمحلول منظف (مثل 2% SDS أو RNaseZap)، ثم شطفها بالماء والإيثانول بتركيز 70%، وتجفيفها قبل استخدامها. س: هل هناك أي ميزة خاصة في خرزات Monarch DNA Capture، أم يمكنني استخدام أي خرز زجاجي؟ ج: خرزات Monarch DNA Capture هي خرزات زجاجية متخصصة من البوروسيليكات، مُحسَّنة لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) في عملية استخلاص Monarch. على الرغم من أن أنواعًا أخرى من الخرز الزجاجي قد تُنقي الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بنجاح، إلا أن خرزات Monarch Capture تُوفر أداءً مثاليًا في التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل Nanopore. لا يمكننا ضمان أداء مماثل باستخدام أي خرز زجاجي آخر غير المُرفق. س: هل تتوافق مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك مع العينات المخزنة في محلول حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك، أو محلول RNAlater، أو محلول DNA/RNA Shield، وما إلى ذلك؟ ج: نعم. بالنسبة لمحلول RNAlater®، يكفي إزالة محلول التثبيت تمامًا قبل المعالجة. بعد ذلك، يمكن اتباع البروتوكولات القياسية. عند استخدام محلول حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك (NEB #T2011) أو محلول DNA/RNA Shield® من زيمو، يجب استخدام المحلول بتخفيف 1X للتحليل، بدلاً من محلول التحليل المرفق في المجموعة. عمومًا، تكون النتائج المُتحصل عليها من المواد الطازجة والمجمدة أفضل من العينات المُثبتة من حيث الكمية والنقاء وطول القطع. س: كيف أعرف أن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي قد التصق بالخرز الزجاجي في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك؟ ج: عندما تحتوي العينات على أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وهو أمر شائع عند العمل بكميات "المدخلات القياسية"، يكون ارتباط الحمض النووي بالخرز مرئيًا، ويظهر على شكل طبقة ضبابية معتمة تغطي الخرز. ستلتصق الخرز ببعضها دائمًا بعد ارتباط هذه الكمية من الحمض النووي بها. عند إجراء عمليات الانقلاب يدويًا باستخدام كميات "المدخلات القياسية"، يمكن رؤية عملية الارتباط ومتابعتها. بعد 5 عمليات انقلاب، يصبح الحمض النووي الضبابي مرئيًا، وفي عمليات الانقلاب العشر التالية، يرتبط بالخرز ويبدأ بالالتفاف حولها. في هذه المرحلة، يبقى المحلول لزجًا. بمجرد أن يلتف الحمض النووي تمامًا حول الخرز خلال عمليات الانقلاب المتبقية (10-15 عملية)، يفقد المحلول لزوجته. عادةً ما تنتج عينات "المدخلات المنخفضة" ما بين 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، وقد يكون من الصعب متابعة ارتباط الحمض النووي. إذا كانت كمية الحمض النووي تتراوح بين 1 و5 ميكروغرامات فقط، فمن غير المرجح أن يكون من الممكن رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز؛ إذ سيبدو أن الخرز يتحرك بحرية واستقلالية في المحلول. أما عند وجود كمية تتراوح بين 5 و10 ميكروغرامات من الحمض النووي، فيصعب رؤية ارتباط الحمض النووي بالخرز، ولكن الحمض النووي المرتبط غالبًا ما يتسبب في التصاق الخرز ببعضه. س: هل هناك أي فائدة من إضافة عملية اختيار الحجم (مثل Circulomics® Short Read Eliminator) بعد الاستخلاص؟ ج: بحسب خبرة NEB، فإن خطوة اختيار الحجم ليست ضرورية عادةً قبل تسلسل النانوبور القائم على الربط. عند العمل بمواد أولية طازجة وعالية الجودة، تكون أطوال قراءة N50 عالية (35-55 كيلوبايت، حسب العينة)، ولن يوفر اختيار حجم إضافي للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي سوى تحسن طفيف في طول القراءة. مع ذلك، عند العمل بمواد أولية ذات جودة منخفضة، مثل تلك التي تم تخزينها بشكل غير مثالي، أو عند العمل بعينات يصعب تحليلها (مثل ذيل الفأر)، سيحتوي الحمض النووي الناتج على نسبة أكبر من الشظايا القصيرة. في هذه الحالات، قد يكون من المفيد إجراء خطوة إثراء لتحسين نتائج التسلسل؛ ويمكن استخدام أي منتج لاختيار الحجم (مثل مُزيل القراءات القصيرة) مع الحمض النووي المعزول باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك. س: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك إذا لم يكن لديّ خلاط حراري؟ ج: إذا كان الهدف هو الحصول على حمض نووي بأقصى حجم، فلا يلزم الرج أثناء التحليل في الخلاط الحراري. مع ذلك، يجب إجراء هضم البروتينيز K عند 56 درجة مئوية. لضمان التحليل السليم، اقلب عينتك عدة مرات ببطء أثناء حضانة البروتينيز K. يُرجى ملاحظة أن العينات التي تم تحليلها بدون تحريك ستكون لزجة للغاية ويصعب التعامل معها. إذا كان الهدف هو ضبط حجم الحمض النووي (DNA) إلى 50-250 كيلوبايت (وهو الحجم الأمثل لتسلسل النانوبور القائم على الربط)، فإننا نوصي بشدة باستخدام خلاط حراري (مثل Eppendorf® ThermoMixer® C). سيؤدي ذلك إلى قص متحكم به للوصول إلى نطاق حجم الشظايا الأمثل. في حال تعذر استخدام الخلاط الحراري، فإن أفضل بديل للتقليب هو استخدام جهاز الخلط الدوامي النبضي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة ممكنة بعد فترة حضانة التحلل. بالنسبة لعينات الأنسجة، قم بتقليب العينة لفترة وجيزة كل دقيقة تقريبًا خلال بداية فترة حضانة التحلل، حتى تختفي جميع قطع الأنسجة. ثم قم بالتقليب مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة بعد انتهاء فترة حضانة التحلل. سؤال: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW) من Monarch لمعالجة عينات نباتية؟ جواب: لا نوصي باستخدام هذه المجموعة لاستخلاص الحمض النووي من النباتات. لا تتم إزالة السكريات المتعددة الموجودة في مستخلصات النباتات بشكل فعال باستخدام محلول تحلل أنسجة الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي المرفق، وهو المحلول الموجود في مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الأنسجة (NEB #T3060). يمنع وجود السكريات المتعددة المتبقية ارتباط الحمض النووي بالخرز الزجاجي. إذا كان لديك نظام تحلل خاص بك يمكن استخدامه مع طريقة عملنا، فنحن نشجعك بشدة على تجربته. أبرزت دراستنا الأولية أهمية البدء بما لا يقل عن 50 ملغ من أنسجة النبات، لأن كفاءة الارتباط بالخرز الزجاجي تتطلب كتلة حرجة من الحمض النووي. استخدام كميات أقل من الحمض النووي لن يوفر كمية كافية منه للسماح بارتباطه بالخرز. في حال تحضير نوى من عينات نباتية، يُرجى اختيار مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة نوى النبات (لم تُصدق NEB على هذه الطريقة، ولكنها ترحب بتجربتها). إذا كانت نوى الخلايا النباتية موجودة في محلول منظم مخصص، فاستخدم هذا المحلول بدلاً من محلول تحضير النوى. أو يمكنك ترسيب النوى وإعادة تعليقها في محلول تحضير النوى، ثم اتباع البروتوكول من هناك. نشجعك على مشاركة ملاحظاتك حول اختبار تقنيتنا على عينات نباتية عبر مراسلتنا على البريد الإلكتروني info@neb.com. سؤال: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الحشرات؟ جواب: لقد نجحنا في عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من بعوضة الزاعجة المصرية (15 ملغ) باستخدام بروتوكول الأنسجة القياسي. مع أننا لم نتحقق داخليًا من صحة النتائج مع أي حشرات أخرى حتى الآن، فقد نجح آخرون في معالجة الذباب والعث والمفصليات (العقارب) وبعض الديدان الأسطوانية. قد تكون الاعتبارات التالية مفيدة: استخدم عينات طازجة إن أمكن؛ قد يؤدي التجميد والذوبان إلى تنشيط نشاط النيوكلياز. عند التعامل مع الحشرات الكبيرة، نوصي بإزالة محتويات الأمعاء (الغنية بالنيوكلياز) قبل التجنيس. يُعد التجنيس الجيد باستخدام المدقة أو جهاز التجنيس الدوار الثابت ضروريًا، ومن المهم إضافة محلول التحلل (الذي يزيل النيوكلياز) بسرعة بعد التجنيس. س: هل يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الخميرة و/أو الفطريات؟ ج: لقد تحققنا من صحة مجموعتنا لمعالجة عينات الخميرة، ونشرنا بروتوكولًا يعتمد على العمل مع عينات خميرة الخباز (S. cerevisiae). لم نختبر المجموعة داخليًا على الفطريات الخيطية. مع ذلك، استنادًا إلى عملنا في تطوير مجموعة السيليكا الخاصة بنا (NEB #T3010)، والتي تستخدم كيمياء تحلل مماثلة، وجدنا أن تركيبتنا الكيميائية قد تكون فعالة مع بعض الفطريات عند تجميد العينة في النيتروجين السائل وطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام المدقة والهاون. بالنسبة للفطر، يجب استخدام مادة أولية مجففة. مع ذلك، ستحتاج هذه الطريقة إلى اختبارها على نوع الفطر المحدد لديك. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة العينات البحرية، بما في ذلك اللافقاريات البحرية؟ ج: لم نختبر المجموعة على هذه الكائنات. غالبًا ما تحتوي هذه الكائنات على الكثير من المخاط/المواد السكرية المتعددة، مما قد يسبب مشاكل أثناء ارتباط الخرز. إذا كانت لديك كيمياء تحلل مُحسَّنة، فقد تتمكن من استخدامها قبل عملية الخرز باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060). س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة طبقة الكريات البيضاء البشرية؟ ج: نعم، يمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة طبقة الكريات البيضاء. عند العمل مع طبقة الكريات البيضاء، وهي محلول مركز من الخلايا الليمفاوية أحادية النواة في الدم المحيطي، يجب استخدام كميات أقل من تلك المستخدمة عند العمل مع الدم. يجب ألا يتجاوز العدد الإجمالي للخلايا 1 × 10⁷ خلية في البروتوكول القياسي (التحريك بسرعة 2000 دورة في الدقيقة)، وألا يتجاوز 5 × 10⁶ خلية عند الحاجة إلى الحمض النووي فائق الوزن الجزيئي (تحريك خفيف). تحتوي الطبقة البيضاء، كما تُستخلص من بنوك الدم، على ما يصل إلى 1 × 10⁹ خلية أحادية النواة في الدم المحيطي لكل 30-80 مل، وهو ما يعادل تقريبًا 1 × 10⁷ - 3 × 10⁷ خلية/مل. نقترح البدء بـ 100-300 ميكرولتر من هذا المحلول، وإضافة محلول ملحي فوسفاتي ليصل الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر، ثم الانتقال إلى إجراء تحليل كريات الدم الحمراء كما لو كانت عينة دم بحجم 500 ميكرولتر. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي فائق الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات غسول الفم؟ ج: لم نختبر ذلك، ولكننا نتوقع أن تعمل مع مجموعة استخلاص الحمض النووي فائق الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050). يتكون تجمع الخلايا في عينة غسول الفم عادةً من خلايا ظهارية فموية وخلايا دم بيضاء. يمكن ترسيب هذه الخلايا وفقًا لتوصيات بروتوكول الخلايا، ونوصي بغسل الراسب بمحلول فوسفات بارد مرة أو مرتين. من المهم وجود عدد كافٍ من الخلايا، لذا قد يتطلب الأمر حجمًا كبيرًا من المادة الأولية، نظرًا لانخفاض كثافة الخلايا (وبالتالي كمية الحمض النووي) في غسول الفم. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة العينات البيئية أو البرازية لدراسات الميتاجينوم؟ ج: لا نوصي باستخدام مجموعتنا لمعالجة العينات البيئية كالتربة أو العينات البرازية. تواجه هذه العينات تحديين رئيسيين: احتواؤها على كمية كبيرة من النيوكلياز، واحتوائها على مثبطات يصعب إزالتها (حمض الهيوميك للتربة، والأحماض الصفراوية للعينات البرازية). يؤدي وجود النيوكلياز إلى تدهور كبير في الحمض النووي، مما يجعله غير مناسب لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، ولن تتمكن التركيبة الكيميائية الحالية للمجموعة من إزالة المثبطات الموجودة في هذه العينات بفعالية. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لعزل الحمض النووي البكتيري الاصطناعي (BAC)؟ ج: لم نختبر ذلك، ولكن نتوقع أن ينجح الأمر لأن تركيبات BAC تقع ضمن النطاق الأمثل للارتباط بالخرز. مع ذلك، عادةً ما تكون تركيبات BAC ذات عدد نسخ منخفض جدًا، وسيلزم كمية كبيرة من المزرعة لتجميع كمية كافية من الحمض النووي BAC للارتباط بالخرز (> 5 ميكروغرام). سيؤدي هذا إلى زيادة أحجام المحاليل اللازمة للتحلل القلوي. إجمالًا، يجب ألا يتجاوز حجم محاليل التحلل القلوي الثلاثة 1100 ميكرولتر حتى يظل الحمض النووي مرتبطًا بالخرز في أنبوب تفاعل سعة 2 مل. قد يتطلب الأمر بعض التحسينات، ولكن من الممكن ربط كيمياء التحلل القلوي بجزء الارتباط بالخرز والتنقية في بروتوكولات مونارك. س: كيف تقترحون تجانس الأنسجة الأكثر صلابة، مثل ثقوب الأذن أو العضلات؟ هل يمكن استخدام جهاز الموجات فوق الصوتية لتجانس الأنسجة؟ ج: لتجانس العينات، نوصي باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة المرفقة أو جهاز التجانس الدوار الثابت. لا يُنصح باستخدام الموجات فوق الصوتية لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) لأنها معروفة بتسببها في تكسر الحمض النووي. أما بالنسبة لتجانس الأنسجة الليفية، فلدينا التوصيات التالية: يمكن تجانس العضلات باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة أو جهاز التجانس الدوار الثابت. نرى أن استخدام المدقة أكثر ملاءمة، ولكن بالنسبة للعينات المجمدة، يوفر جهاز التجانس الدوار الثابت أطوال قراءة N50 أفضل نوعًا ما. تعمل مثاقب الأذن وأطراف الذيل بشكل أفضل مع مدقة الأنابيب الدقيقة، حيث أن جهاز التجانس الدوار الثابت ذو الأطراف القابلة للاستخدام لمرة واحدة (Tissueruptor II) غير قادر على تفتيت الأنسجة بفعالية. من المحتمل أن يكون جهاز التجانس الدوار الثابت ذو الأطراف المعدنية الحادة غير القابلة للاستخدام لمرة واحدة خيارًا أفضل، لكننا لم نختبر ذلك. مع ذلك، فقد حصلنا على نتائج ممتازة مع مثاقب الأذن باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة. باختصار، تقوم المدقة بتقسيم عينة ثقب الأذن إلى ثلاث طبقات رقيقة يسهل وصول محلول تحلل الأنسجة وإنزيم البروتينيز K إليها، مما يوفر حمضًا نوويًا عالي الوزن الجزيئي (HMW) بجودة ممتازة. نوصي باستخدام ثقبين من الأذن لكل عينة لتحقيق أعلى كفاءة ربط. تُعد أطراف الذيل عينات صعبة للغاية. يُفضل استخدام مسحوق مُحضر بالطحن باستخدام النيتروجين السائل. ولكن في حال عدم توفر هذا الخيار، تُساعد المدقة، إلا أن إنزيم البروتينيز K سيستغرق عدة دقائق لتحليل النسيج المتجانس تمامًا. ونتيجة لذلك، يكون الحمض النووي المُستخلص من ذيل الفأر أكثر تقطعًا وأصغر حجمًا من ذلك المُستخلص من ثقب الأذن. وبناءً على ذلك، قد تُؤدي خطوة إزالة القراءات القصيرة إلى أطوال قراءة أفضل في تسلسل النانوبور. س: هل تعمل المجموعة مع الأنسجة المُجمدة، أو الأنسجة المحفوظة في مواد حافظة (الإيثانول، أو DMSO-salt/DESS، أو RNAlater®)، أو عينات FFPE، أو الأنسجة المحفوظة في OCT؟ ج: لقد اختبرنا بنجاح العديد من خيارات حفظ عينات الأنسجة المُجمدة، ولكن يُفضل دائمًا استخدام مواد طازجة كلما أمكن ذلك. عند عدم توفر عينات طازجة، يُنصح بالتجميد، ويُفضل التجميد السريع باستخدام النيتروجين السائل والتخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. عند إذابة العينات، يُراعى عدم إعطاء النيوكليازات وقتًا كافيًا لإتلاف الحمض النووي، ويمكن ضمان ذلك بإجراء التجنيس بسرعة وخلط العينة مع محلول التحلل فور إذابتها وتجنيسها. ومن المثير للاهتمام أن عينات الأنسجة المجمدة غالبًا ما تُعطي نتائج أفضل من حيث طول قطع الحمض النووي وسلامتها مقارنةً بتلك المخزنة في محاليل الحفظ. لقد اختبرنا كاشف حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك (NEB #T2011)، وRNAlater، وDNA/RNA Shield، وRNAssist. على الرغم من أن هذه الكواشف تحفظ العينات بفعالية، إلا أن وجودها يمنع الهضم السريع لمادة الأنسجة خلال المرحلة الأولية من التحلل، مما قد يؤدي إلى بعض التمزق/تلف الحمض النووي. في تجربتنا، يُعطي كاشف حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك نتائج أفضل نوعًا ما من RNAlater وRNAssist. يمكن استخدام الأنسجة المحفوظة بالإيثانول كمادة أولية. قبل البدء بعملية التحلل، يجب إزالة الإيثانول بغسل العينات بمحلول ملحي متوسط ​​التركيز؛ تتوفر تفاصيل إضافية عند الطلب (تواصلوا معنا عبر البريد الإلكتروني info@neb.com). تم اختبار الخلايا المجمدة المحفوظة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وأعطت حمضًا نوويًا عالي الجودة. لم نختبر تقنية DESS، لكننا نفترض أنها ستعمل بنفس الكفاءة. عينات FFPE غير مناسبة لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) نظرًا لترابطها العالي، مما يؤدي إلى تكسر وتفكك كبيرين للحمض النووي أثناء عملية التنقية الدقيقة المطلوبة لهذه العينات. عادةً، لا تُعد عينات FFPE مادةً مناسبةً لمن يبحثون عن حمض نووي عالي الوزن الجزيئي، لأن الحمض النووي المنقى غالبًا ما يكون أقل من 1 كيلوبايت ويكون متفككًا. قد تكون عينات OCT مناسبة، لأن العينات المثبتة بـ OCT غير مترابطة، لكننا لم نختبر ذلك. نشجع المستخدمين على تجربتها باستخدام مجموعاتنا التجريبية المجانية. من الأفضل دائمًا البدء بكمية متوسطة من الكمية الموصى بها (مثل 10-15 ملغ). قبل البدء باستخلاص الحمض النووي، أزل أكبر قدر ممكن من مادة OCT. س: هل تلاحظ اختلافًا في نتائج التجزئة عند استخدام المدقة مقارنةً بجهاز التجنيس الدوار الثابت لتجنيس الأنسجة؟ ج: إذا كان الهدف هو عزل الحمض النووي ذي الوزن الجزيئي العالي جدًا، فإن التجنيس باستخدام المدقة في الأنابيب الدقيقة هو الخيار الأمثل. يُعد جهاز التجنيس الدوار الثابت (RSH) بديلاً فعالاً، ولكن قد يتعرض الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي الذي يُطلق في المحلول إلى درجة طفيفة من القص أثناء عملية التجنيس. لذلك، لاستخلاص أطول شظايا الحمض النووي باستخدام جهاز RSH، يجب استخدامه على أقل إعداد، ويجب إيقاف تشغيل الجهاز فورًا بمجرد تفتيت قطع الأنسجة تمامًا. بشكل عام، في التجنيس باستخدام المدقة، كلما كان تجنيس العينة أكثر دقة، قلّ وقت التحلل، وزاد حجم الحمض النووي وسلامته. يجب طحن العينة إلى أرق طبقة ممكنة لتسريع عملية التحلل بواسطة بروتينيز K. مع ذلك، يؤثر تركيب النسيج أيضًا على سرعة التحلل، وبالتالي على طول الشظايا. تتحلل أنسجة الأعضاء الرخوة والدماغ في غضون ثوانٍ، مما ينتج عنه أطول الشظايا؛ أما أنسجة العضلات فقد تحتاج إلى وقت أطول قليلاً، ولكنها تتحلل في غضون دقيقة تقريبًا. تحتاج الأنسجة الليفية شديدة الصلابة (مثل ذيل الفأر) إلى عدة دقائق لتتحلل تمامًا، ولذلك تميل إلى إنتاج شظايا DNA أقصر. نظرًا لعدم إمكانية إعادة تعليق خلايا الأنسجة بحرية كما هو الحال مع الخلايا المستنبتة، تتحلل أجزاء من الخلايا في وقت واحد، مما يتسبب في تشابك DNA عالي الوزن الجزيئي. يمكن ملاحظة هذا التشابك على شكل تلطخ تصاعدي في مسار هلام المجال النبضي. يمكن معالجة هذه التجمعات بجهاز التجنيس الدوار الثابت، في معظم الحالات. مع ذلك، قد تتطلب العينات المعالجة بالمدقة، خاصةً عند استخدام أنسجة مجمدة، بعض القص بالإبرة لفصل تجمعات DNA هذه من أجل الحصول على نتائج تسلسل قراءة طويلة مثالية. تُنتج تقنيات التجنيس بالمدقة والتجنيس باستخدام جهاز التجنيس الدوار-الثابت أطوالًا مختلفة للشظايا. تم تنقية الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي من أنسجة الأعضاء الرخوة (كلية الفأر، كبد الفأر، 10 ملغ)، والأنسجة الدهنية (دماغ الفأر، 20 ملغ)، والأنسجة الليفية (عضلة الفأر، 20 ملغ)، بالإضافة إلى البكتيريا سالبة الغرام وموجبة الغرام (الإشريكية القولونية، 2 × 10⁸ خلية، والعصوية الشمعية، 2 × 10⁹ خلية) باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الأنسجة (Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue) مع طرق تجنيس مختلفة: المدقة (P)، وجهاز التجنيس الدوار-الثابت (TissueRuptor II) (R)، أو الخلاط الحراري (T). تم فصل 300 نانوغرام من الحمض النووي لكل عينة على هلام Pippin Pulse™ (Sage Science) باستخدام برنامج 5-430 كيلو قاعدة. أدى القص الشديد الناتج عن جهاز التجنيس الدوار-الثابت إلى تقليل طول الشظايا مقارنةً بالتجنيس بالمدقة مع التحريك في الخلاط الحراري. س: هل لديكم أي نتائج تسلسل PacBio للحمض النووي المستخلص من عينات الأنسجة باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch؟ ج: نعم، لقد أجرينا تجارب مقارنة مع مكتبات PacBio SMRTbell المُحضّرة باستخدام الحمض النووي من الخلايا (HEK293)، والدم (الخنزير)، والبكتيريا (الإشريكية القولونية)، وعينات الأنسجة (كلية الفأر). في عمليات التشغيل المُرمّزة، كانت جميع مقاييس التسلسل متشابهة جدًا. تم تشغيل المكتبات المُحضّرة باستخدام الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي المُنقّى بواسطة Monarch بمقاييس ممتازة على جهازي Sequel I وSequel II. وقد أظهر الحمض النووي أداءً جيدًا في عمليات التسلسل التقليدية وHiFi. س: هل تعمل آلية استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من Monarch مع الخلايا المفردة؟ ج: للأسف، هذه الآلية غير متوافقة للاستخدام مع الخلايا المفردة. يتطلب النظام وجود كتلة حرجة من الحمض النووي (≥ 1 ميكروغرام في ~100 ميكرولتر) للارتباط الفعال بالخرز. س: هل يمكن استخدام الحمض النووي المستخلص باستخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك في تحليل ساوثرن بلوت؟ ج: نعم، يمكن استخدام الحمض النووي المستخلص لتحليل ساوثرن بلوت. تأكد من فصل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي على هلام نبضي، لأنه على هلام الأغاروز العادي، سيعلق الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في فتحات الهلام. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة الديدان الأسطوانية؟ ج: نعم. لقد نجحنا في استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من دودة C. elegans باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060) باتباع البروتوكول القياسي لعينات الأنسجة (تمت معالجة الديدان من طبقين). نوصي باستخدام جهاز تجنيس دوار-ثابت لتجانس العينة للحصول على أفضل النتائج. س: أواجه صعوبة في إذابة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد استخلاصه. هل لديكم أي نصائح لزيادة الذوبان؟ ج: من المعروف أن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي يصعب إذابته. عندما تكون عينات الحمض النووي عالية التركيز أو تحتوي على حمض نووي ذي وزن جزيئي فائق، يصبح إذابتها أكثر صعوبة. بشكل عام، كلما زاد انضغاط الحمض النووي، زادت صعوبة إذابته. توفر حبيبات الزجاج المستخدمة في مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك سطحًا واسعًا يلتف حوله الحمض النووي، مما يحافظ عليه في حالة مفتوحة، ويسهل إذابته. مع ذلك، قد تظل الذوبانية مشكلة. فيما يلي بعض النصائح لزيادة ذوبان الحمض النووي عند استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك: حاول تقليل مدة ارتباط الحمض النووي بالحبيبات دون وجود سائل. بعد إزالة السائل من الحبيبات، أضف المحلول المنظم التالي فورًا. كلما طالت مدة جفاف الحمض النووي على الحبيبات، زاد انضغاطه، وصعب إذابته لاحقًا. عند ربط الحمض النووي بالحبيبات، لا تقلب العينة لفترة أطول من الموصى بها. كلما زادت مدة التفاف الحمض النووي حول الحبيبات، زاد انضغاطه، وصعب إذابته لاحقًا. راجع دليل الاستخدام الخاص بنا، "تجانس عينات الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) بعد الإذابة"، لمزيد من النصائح حول تجانس الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي بعد الإذابة. س: لم يتم تخزين الإنزيمات الموجودة في المجموعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية فورًا. هل ستظل فعالة؟ ج: نعم، إنزيمات بروتينيز K وRNAse A من Monarch غير المفتوحة مستقرة في درجات الحرارة المحيطة لفترة قصيرة. بعد الفتح، يجب تخزين بروتينيز K وRNAse A من Monarch عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. س: يوجد راسب في أنبوب إنزيم بروتينيز K، هل هذا طبيعي؟ ج: من الشائع رؤية راسب أبيض غير متبلور في أنبوب بروتينيز K. لا يوجد أي تأثير على نشاط بروتينيز K أو وظيفة المجموعة، لذا يمكنك المتابعة كالمعتاد في سير عملك. س: ما هي أعمدة Monarch® وحوامل الخرز التي يمكن استخدامها مع أي أنبوب تجميع Monarch؟ أ: أنابيب تجميع مونارك سبين (NEB# T2118) متوافقة مع أعمدة تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك (NEB #T2007)؛ وأعمدة إزالة الحمض النووي الجينومي (gDNA) من مونارك (NEB #T2017)؛ وأعمدة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك (NEB #T2037، #T2047، #T2057)؛ وأعمدة تنقية الحمض النووي الجينومي (gDNA) من مونارك (NEB #T3017)؛ وحلقات تثبيت الخرز من مونارك (NEB #T3004). أنابيب تجميع مونارك (NEB #T1018) متوافقة مع أعمدة تحضير البلازميد المصغرة من مونارك (NEB #T1017)، وأعمدة تنظيف الحمض النووي (DNA) من مونارك (NEB #T1034). أنابيب تجميع مونارك II (NEB #T2018) متوافقة مع أعمدة تنظيف الحمض النووي الريبوزي (RNA) من مونارك (NEB #T2037، #T2047، #T2057) (من خلال دفعات محددة). أعمدة تنقية الحمض النووي الجينومي من مونارك (NEB #T3017) (ضمن دفعات محددة)؛ وحوامل الخرز من مونارك (NEB #T3004) (ضمن دفعات محددة). س: لاحظتُ تغييرًا طفيفًا في أبعاد أنبوب التجميع في مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050) ومجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060). هل سيؤثر هذا على الأداء؟ ج: تعمل شركة NEB على توحيد كمية البلاستيك المستخدمة في مجموعاتها لتقليل النفايات أثناء الإنتاج. لن تؤثر التغييرات الطفيفة في الأبعاد على أداء المنتج. س: لاحظتُ أنني أبذل جهدًا لإدخال العمود في أنبوب التجميع. هل هذا طبيعي؟ ما هي أنابيب التجميع المتوافقة مع الأعمدة؟ ج: يتم توفير أنابيب تجميع متطابقة في جميع مجموعات مونارك لأعمدة الطرد المركزي. إذا كنت تستخدم أنابيب تجميع من خارج المجموعة، فيُرجى استخدام أنابيب تجميع مونارك للطرد المركزي (NEB #T2118). تجنب إدخال أي أعمدة بالقوة في أنابيب تجميع غير مُوصى بها ذات إحكام شديد لتفادي تلف العمود. س: لقد استخدمتُ كل كمية بروتينيز K (NEB #P8200) المُضمنة في مجموعة Monarch. هل يُمكنني شراء المزيد؟ ج: نعم، بروتينيز K، من الدرجة الجزيئية (NEB #P8107)، مُتاح للشراء بشكل مُنفصل، ويُمكن استخدامه كبديل مُباشر لـ (NEB #P8200) في جميع بروتوكولات Monarch دون أي تعديلات.