نيو إنجلاند بيولابس، T3061L، محلول تحلل أنسجة الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي Monarch®

الفئات ذات الصلة: استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، تنقية الأحماض النووية. الأسئلة الشائعة: س: هل يمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات نباتية؟ ج: لا نوصي باستخدام هذه المجموعة لاستخلاص الحمض النووي من النباتات. لا تتم إزالة السكريات المتعددة الموجودة في مستخلصات النباتات بشكل فعال بواسطة محلول تحلل أنسجة الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي المرفق، وهو محلول التحلل الموجود في مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060). يمنع وجود السكريات المتعددة المتبقية ارتباط الحمض النووي بالخرز الزجاجي. إذا كان لديك نظام تحلل خاص بك يمكن استخدامه مع طريقة عملنا، فنحن نشجعك بالتأكيد على تجربته. أبرزت دراستنا الأولية أهمية البدء بما لا يقل عن 50 ملغ من الأنسجة النباتية لأن كفاءة الارتباط بالخرز الزجاجي تتطلب كتلة حرجة من الحمض النووي. استخدام كميات أقل من الحمض النووي لن يوفر كمية كافية للسماح بالارتباط بالخرز. في حال تحضير نوى الخلايا من عينات نباتية، يُرجى اختيار مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للخلايا والدم (NEB #T3050) لمعالجة نوى الخلايا النباتية (لم تُجرِ NEB أي اختبارات على هذه الطريقة، ولكننا نرحب بتجربتها). إذا كانت نوى الخلايا النباتية موجودة في محلول منظم مخصص، فاستخدم هذا المحلول بدلاً من محلول تحضير النوى. أو بدلاً من ذلك، قم بترسيب النوى وإعادة تعليقها في محلول تحضير النوى، ثم اتبع البروتوكول المتبع. نشجعكم على مشاركة ملاحظاتكم حول اختبار تقنيتنا مع عينات نباتية عبر مراسلتنا على البريد الإلكتروني info@neb.com. سؤال: هل يُمكنني استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الحشرات؟ جواب: لقد نجحنا في عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من بعوضة الزاعجة المصرية (15 ملغ) باستخدام بروتوكول الأنسجة القياسي. مع أننا لم نُجرِ أي اختبارات داخلية على أي حشرات أخرى حتى الآن، فقد نجح آخرون في معالجة الذباب والعث والمفصليات (العقارب) وبعض الديدان الأسطوانية. قد تكون الاعتبارات التالية مفيدة: يُفضل استخدام عينات طازجة؛ إذ يُمكن أن يُؤدي التجميد والذوبان إلى تنشيط نشاط النيوكلياز. عند التعامل مع الحشرات الكبيرة، نوصي بإزالة محتويات الأمعاء (الغنية بالنيوكلياز) قبل التجنيس. يُعد التجنيس الجيد باستخدام المدقة أو جهاز التجنيس الدوار الثابت ضروريًا، ومن المهم إضافة محلول التحلل (الذي يُزيل النيوكلياز) بسرعة بعد التجنيس. س: هل يُمكن استخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة عينات الخميرة و/أو الفطريات؟ ج: لقد تحققنا من صحة مجموعتنا لمعالجة عينات الخميرة، ونشرنا بروتوكولًا قائمًا على العمل مع عينات خميرة الخباز (S. cerevisiae). لم نُجرِ اختبارات داخلية على المجموعة على الفطريات الخيطية. مع ذلك، استنادًا إلى عملنا في تطوير مجموعة السيليكا الخاصة بنا (NEB #T3010)، والتي تستخدم كيمياء تحلل مماثلة، وجدنا أن تركيبتنا الكيميائية قد تُناسب بعض أنواع الفطريات عند تجميد العينة في النيتروجين السائل وطحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام المدقة والهاون. بالنسبة للفطر، يجب استخدام مادة أولية مجففة. مع ذلك، يتطلب هذا النهج اختباره على نوعك المحدد. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة العينات البحرية، بما في ذلك اللافقاريات البحرية؟ ج: لم نختبر المجموعة على هذه الكائنات. غالبًا ما تحتوي هذه الكائنات على كمية كبيرة من المخاط/المواد السكرية المتعددة، مما قد يُسبب مشاكل أثناء ارتباط الخرز. إذا كانت لديك كيمياء تحلل مُحسّنة، فقد تتمكن من استخدامها قبل عملية الخرز باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك للأنسجة (NEB #T3060). س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لمعالجة العينات البيئية أو البرازية لدراسات الميتاجينوم؟ ج: لا نوصي باستخدام مجموعتنا لمعالجة العينات البيئية مثل التربة أو العينات البرازية. تواجه هذه العينات تحديين رئيسيين: كلاهما يحتوي على نسبة عالية جدًا من النيوكلياز، ويحتويان على مثبطات يصعب إزالتها (حمض الهيوميك للتربة، والأحماض الصفراوية للعينات البرازية). يؤدي عبء النيوكلياز إلى تدهور كبير في الحمض النووي، مما يجعله غير مناسب بطبيعته لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي، ولن تتمكن التركيبة الكيميائية الحالية للمجموعة من إزالة المثبطات الموجودة في هذه العينات بفعالية. س: هل يمكن استخدام مجموعات استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من مونارك لعزل الحمض النووي البكتيري الاصطناعي (BAC)؟ ج: لم نختبر ذلك، لكننا نتوقع أن ينجح الأمر لأن تركيبات BAC تقع ضمن النطاق الأمثل لحجم ارتباط الخرز. مع ذلك، عادةً ما تكون تركيبات BAC ذات عدد نسخ منخفض جدًا، وسيلزم كمية كبيرة من المزرعة لتجميع كمية كافية من الحمض النووي BAC لارتباط الخرز (> 5 ميكروغرام). سيؤدي هذا إلى زيادة أحجام المحاليل المنظمة اللازمة في التحلل القلوي. إجمالًا، يجب ألا يتجاوز حجم محاليل التحلل القلوي الثلاثة 1100 ميكرولتر حتى يظل الحمض النووي مرتبطًا بالخرز في أنبوب تفاعل سعة 2 مل. قد يتطلب الأمر بعض التحسينات، ولكن من الممكن ربط كيمياء التحلل القلوي بجزء ربط الخرز والتنقية في بروتوكولات مونارك. س: كيف تقترحون تجانس الأنسجة الأكثر صلابة، مثل عينات الأذن أو العضلات؟ هل يمكن استخدام جهاز الموجات فوق الصوتية لتجانس الأنسجة؟ ج: لتجانس العينات، نوصي باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة المرفقة أو جهاز التجانس الدوار الثابت. لا يُنصح باستخدام الموجات فوق الصوتية لاستخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA) لأنها معروفة بتسببها في قص الحمض النووي. أما بالنسبة لتجانس الأنسجة الليفية، فلدينا التوصيات التالية: يمكن تجانس العضلات باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة أو جهاز التجانس الدوار الثابت. نرى أن استخدام المدقة أكثر ملاءمة، ولكن بالنسبة للعينات المجمدة، يوفر جهاز التجانس الدوار الثابت أطوال قراءة N50 أفضل نوعًا ما. تعمل عينات الأذن وأطراف الذيل بشكل أفضل مع مدقة الأنابيب الدقيقة، حيث أن جهاز التجانس الدوار الثابت المزود برؤوس قابلة للاستخدام لمرة واحدة (Tissueruptor II) غير قادر على تفتيت الأنسجة بفعالية. من المحتمل أن يكون جهاز التجنيس ذو الدوار الثابت المزود برؤوس معدنية حادة غير قابلة للاستخدام لمرة واحدة خيارًا أفضل، لكننا لم نختبر ذلك. مع ذلك، فقد حصلنا على نتائج ممتازة باستخدام مدقة الأنابيب الدقيقة مع عينات ثقب الأذن. تقوم المدقة أساسًا بتقسيم عينة ثقب الأذن إلى ثلاث طبقات رقيقة يسهل وصول محلول تحلل الأنسجة وإنزيم البروتينيز K إليها، مما يوفر حمضًا نوويًا عالي الوزن الجزيئي (HMW) بجودة عالية جدًا. نوصي باستخدام عينتين من ثقب الأذن لكل عينة لتحقيق أعلى كفاءة ربط. تُعد عينات أطراف الذيل صعبة للغاية. من الناحية المثالية، يُفضل استخدام مسحوق مصنوع عن طريق الطحن باستخدام النيتروجين السائل. ولكن إذا لم يكن هذا الخيار متاحًا، فإن المدقة تُساعد، لكنها لا تزال تستغرق عدة دقائق لإنزيم البروتينيز K لتحليل النسيج المتجانس تمامًا. نتيجة لذلك، يكون الحمض النووي المعزول من ذيل الفأر أكثر تقطعًا وأصغر حجمًا من ذلك المعزول من ثقب الأذن. بناءً على ذلك، قد تؤدي خطوة إزالة القراءات القصيرة إلى أطوال قراءة أفضل في تسلسل النانو المسامي. س: هل تعمل هذه المجموعة مع الأنسجة المجمدة، أو الأنسجة المحفوظة في مواد حافظة (الإيثانول، أو محلول ملح DMSO/DESS، أو RNAlater®)، أو عينات FFPE، أو الأنسجة المحفوظة في OCT؟ ج: لقد اختبرنا بنجاح العديد من خيارات حفظ عينات الأنسجة المجمدة، ولكن يُفضل دائمًا استخدام عينات طازجة كلما أمكن. عندما لا تتوفر عينات طازجة، يُنصح بالتجميد، ويُفضل التجميد السريع باستخدام النيتروجين السائل والتخزين عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. عند إذابة العينات، الهدف هو عدم إعطاء النيوكليازات وقتًا كافيًا لإتلاف الحمض النووي، ويمكن ضمان ذلك بإجراء التجنيس بسرعة وخلط العينة مع محلول التحلل فور إذابتها وتجنيسها. ومن المثير للاهتمام أن عينات الأنسجة المجمدة غالبًا ما تُعطي نتائج أفضل من حيث طول وسلامة شظايا الحمض النووي مقارنةً بتلك المحفوظة في مواد حافظة. لقد اختبرنا كاشف حماية الحمض النووي/الرنا Monarch (NEB #T2011)، وRNAlater، وDNA/RNA Shield، وRNAssist. على الرغم من أن هذه الكواشف تحافظ على العينات بفعالية، إلا أن وجودها يمنع الهضم السريع لمادة الأنسجة خلال المرحلة الأولية من التحلل، مما قد يؤدي إلى بعض التمزق/تلف الحمض النووي. وحسب تجربتنا، فإن كاشف حماية الحمض النووي/الرنا من مونارك يُعطي نتائج أفضل نوعًا ما من RNAlater وRNAssist. يمكن استخدام الأنسجة المحفوظة بالإيثانول كمادة أولية. قبل بدء عملية التحلل، يجب إزالة الإيثانول بغسل العينات بمحلول ملحي متوسط ​​التركيز؛ تتوفر تفاصيل إضافية عند الطلب (تواصلوا معنا عبر البريد الإلكتروني info@neb.com). تم اختبار الخلايا المجمدة المحفوظة بـ DMSO وأعطت حمضًا نوويًا عالي الجودة. لم نختبر DESS ولكننا نفترض أنه سيعمل بنفس الكفاءة. عينات FFPE غير مناسبة لعزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي لأنها شديدة التشابك، مما يؤدي إلى تكسر وتشويه كبيرين للحمض النووي أثناء عملية التنقية الدقيقة المطلوبة لهذه العينات. عادةً، لا تُعدّ عينات FFPE مادةً مناسبةً لمن يبحثون عن الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي (HMW DNA)، لأنّ الحمض النووي المُستخلص منها يكون في الغالب أقل من 1 كيلوبايت، ويكون مُتَمَسِّخًا. قد تُناسب عينات OCT، لأنّها غير مُتشابكة، ولكننا لم نُجرِ اختباراتٍ عليها. نُشجّع المستخدمين على تجربتها باستخدام مجموعاتنا التجريبية المجانية. يُنصح دائمًا بالبدء بكميةٍ متوسطةٍ من الكمية المُوصى بها (مثلًا، 10-15 ملغ). قبل البدء باستخلاص الحمض النووي، أزِل أكبر قدرٍ مُمكن من OCT. س: هل تُلاحظ نتائج تجزئةٍ مُختلفةٍ عند استخدام المدقة مُقارنةً بجهاز التجنيس الدوّار الثابت لتجنيس الأنسجة؟ ج: إذا كان الهدف هو عزل الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي للغاية، فإنّ التجنيس باستخدام المدقة في الأنابيب الدقيقة هو الخيار الأمثل. يُعدّ جهاز التجنيس الدوّار الثابت بديلًا فعّالًا، ولكن قد يتعرّض الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي المُستخلص في المُستخلص إلى درجةٍ طفيفةٍ من القصّ أثناء عملية التجنيس. لذا، لاستخلاص أطول شظايا الحمض النووي باستخدام جهاز RSH، يُنصح باستخدامه على أدنى إعداد، وإيقاف تشغيله فورًا بعد تفتيت قطع الأنسجة تمامًا. عمومًا، في عملية التجنيس بالمدقة، كلما زاد تجنيس العينة، قصر وقت التحلل، وزاد حجم الحمض النووي وسلامته. يجب طحن العينة إلى طبقة رقيقة قدر الإمكان لتسريع عملية التحلل بواسطة بروتينيز K. مع ذلك، يؤثر تركيب النسيج أيضًا على سرعة التحلل، وبالتالي على طول الشظايا. تتحلل أنسجة الأعضاء الرخوة والدماغ في ثوانٍ، وتُنتج أطول الشظايا؛ قد تحتاج أنسجة العضلات إلى وقت أطول قليلًا، ولكن ينبغي أن تتحلل في غضون دقيقة تقريبًا. أما الأنسجة الليفية شديدة الصلابة (مثل ذيل الفأر) فتحتاج إلى عدة دقائق لتتحلل تمامًا، ولذلك تميل إلى إنتاج شظايا حمض نووي أقصر. نظرًا لعدم إمكانية إعادة تعليق خلايا الأنسجة بحرية كما هو الحال مع الخلايا المستنبتة، تتحلل أجزاء من الخلايا في وقت واحد، مما يُسبب تشابكًا في الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي. يمكن ملاحظة هذا التشابك على شكل تلطخ تصاعدي في مسار هلام المجال النبضي. يمكن معالجة العينات بجهاز التجنيس الدوار-الثابت لفصل هذه التجمعات، في معظم الحالات. مع ذلك، قد تتطلب العينات المعالجة بالمدقة، وخاصة عند استخدام الأنسجة المجمدة، بعض القص بالإبرة لفصل تجمعات الحمض النووي هذه من أجل الحصول على نتائج تسلسل قراءة طويلة مثالية. تُنتج تقنيات التجنيس بالمدقة والتجنيس باستخدام جهاز التجنيس الدوار-الثابت أطوالًا مختلفة للشظايا. تم تنقية الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي من أنسجة الأعضاء الرخوة (كلية الفأر، كبد الفأر، 10 ملغ)، والأنسجة الدهنية (دماغ الفأر، 20 ملغ)، والأنسجة الليفية (عضلة الفأر، 20 ملغ)، بالإضافة إلى البكتيريا سالبة الغرام وموجبة الغرام (الإشريكية القولونية، 2 × 10⁸ خلية، والعصوية الشمعية، 2 × 10⁹ خلية) باستخدام مجموعة استخلاص الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من الأنسجة (Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue) مع طرق تجنيس مختلفة: المدقة (P)، وجهاز التجنيس الدوار-الثابت (TissueRuptor II) (R)، أو الخلاط الحراري (T). تم فصل 300 نانوغرام من الحمض النووي لكل عينة على هلام Pippin Pulse™ (Sage Science) باستخدام برنامج 5-430 كيلو قاعدة. أدى القص الشديد الناتج عن جهاز التجنيس الدوار-الثابت إلى تقليل طول الشظايا مقارنةً بالتجنيس بالمدقة مع التحريك في الخلاط الحراري.