كياجين، 1027292، أول ستارز نيغ. سيرنا AF 488 (20 نانومول)

تم اختبار siRNA غير المثبط للصوت والتحقق من صحته بدقة، مع تعديل Alexa Fluor 488

سمات

- أكثر عناصر التحكم السلبية التي تم التحقق منها بدقة متاحة
- لا يوجد تشابه مع أي جين معروف لدى الثدييات
- تأثيرات غير محددة ضئيلة
- يمكن استخدامه في تجارب محاكاة الحمض النووي الريبوزي الميكروي

أداء

نوع الاختبار: اسم الاختبار
تحليل على مستوى الجينوم: مصفوفات Affymetrix GeneChip
فحص قائم على الخلايا: تلوين نوى الخلايا الحية
فحص قائم على الخلايا: عدد الخلايا
فحص قائم على الخلايا: دمج النيوكليوتيدات
فحص قائم على الخلايا: استبعاد الصبغة في الخلايا الحية
فحص قائم على الخلايا: تلوين الحمض النووي
تحليل دمج RISC (خلايا HeLa و MCF-7): نقل بناء التقرير

- تم إنشاء بنية مراسل تحتوي على تسلسل هدف siRNA اصطناعي مكمل لتسلسل siRNA للتحكم السلبي AllStars المدمج مع جين مراسل فلوري مع علامة His (انظر الشكل "بنية المراسل لتجربة دمج RISC").
- تم نقل جين المراسل بالتزامن مع إما siRNA التحكم السلبي AllStars أو siRNA غير مكمل. كما تم تحليل الخلايا غير المنقولة.
أُجري فحص مجهري فلوري وفحص فرز الخلايا بالفلورة (FACS) للكشف عن تعبير جين المؤشر الفلوري. كما أُجري تحليل لطخة ويسترن للكشف عن تعبير البروتين المدمج عبر علامة الهيستيدين (His tag). أدى نقل جين المؤشر مع siRNA غير مكمل إلى تعبير قوي للبروتين الفلوري وعلامة الهيستيدين. عند نقل الجين مع siRNA التحكم السلبي AllStars، قام siRNA بتثبيط التعبير من تسلسله المكمل، مما أدى إلى تحلل كامل نسخة mRNA التي تشفر جين المؤشر الفلوري وعلامة الهيستيدين وتسلسل هدف siRNA. نتج عن تحلل mRNA تثبيط البروتين المدمج (انظر الشكلين "دمج siRNA التحكم السلبي AllStars في RISC" و"يُظهر تحليل ويسترن دخول siRNA التحكم السلبي AllStars إلى RISC"). لتحقيق التثبيط الملاحظ، يجب أن يكون siRNA التحكم السلبي AllStars قد دخل إلى RISC.

تم التحقق من أداء AllStars Negative Control siRNA من خلال التجارب الموضحة في الجدول.

مصفوفات Affymetrix GeneChip

أُجري تحليل على مستوى الجينوم لاختبار مستوى التأثيرات غير النوعية على التعبير الجيني بعد نقل جزيئات siRNA متعددة للتحكم السلبي. نُقلت جزيئات siRNA متعددة للتحكم السلبي من مصادر مختلفة إلى خلايا MCF-7 وK562 وخلايا HUVEC الأولية باستخدام كاشف النقل HiPerFect. شملت هذه الجزيئات جزيئات siRNA غير المُثبِّطة (التي لا تُظهر أي تشابه مع جينات الثدييات)، وجزيئات siRNA المُشوشة (جزيئات siRNA لها نفس التركيب القاعدي لجزيء siRNA المُستهدف للجين ولكن بتسلسل مُعدَّل)، وجزيئات siRNA التي تستهدف جينات مُبلِّغة اصطناعية. بعد ذلك، أُجري تحليل التعبير الجيني للجينوم البشري الكامل باستخدام مصفوفات Affymetrix GeneChip. أظهرت جزيئات siRNA للتحكم السلبي AllStars باستمرار أقل عدد من الجينات المُنظَّمة بشكل غير نوعي، مما يجعلها عنصر تحكم سلبي مناسبًا للغاية. في المقابل، أدت جزيئات siRNA الأخرى للتحكم السلبي إلى تنظيم غير نوعي للعديد من الجينات من مسارات خلوية مهمة (انظر الشكل "تأثيرات غير نوعية منخفضة على التعبير").

تلوين نوى الخلايا الحية

استُخدم تلوين نوى الخلايا الحية لقياس حجم النواة. قد تشير التغيرات في الحجم إلى اضطراب في دورة الخلية أو تثبيط النمو. تم اختبار مجموعة من جزيئات siRNA الضابطة السالبة من أنواع مختلفة. وقد حقق جزيء AllStars Negative Control siRNA أفضل النتائج من بين جميع الضوابط المختبرة. لم يُحدث نقل جزيء AllStars Negative Control siRNA أي تغيير في حجم النواة مقارنةً بالخلايا غير المنقولة. في المقابل، أدى نقل جزيء siRNA ضابط سالب آخر (الضابط 1) إلى تضخم النوى (انظر الشكل "لم يتأثر النمط الظاهري لحجم النواة").

عدد الخلايا

تم تقييم عدد الخلايا بعد نقل مجموعة من جزيئات siRNA الضابطة السالبة لتحديد ما إذا كانت الخلايا تتكاثر بشكل طبيعي. لم يُلاحظ أي فرق يُذكر في عدد الخلايا بين الخلايا غير المنقولة والخلايا المنقولة بجزيئات siRNA الضابطة السالبة AllStars. في المقابل، انخفض عدد الخلايا بشكل ملحوظ بعد النقل بجزيئات siRNA ضابطة سالبة أخرى تم اختبارها، مثل Control 1، مما يشير إلى أن هذه الجزيئات أدت إلى خلل في النمو (انظر الشكل "عدد الخلايا غير متأثر").

دمج النيوكليوتيدات

تم قياس معدل دمج النيوكليوتيدات لتحديد معدلات تخليق الحمض النووي في خلايا HCT-116 غير المُعدَّلة وراثيًا، وفي خلايا HCT-116 المُعدَّلة وراثيًا باستخدام مجموعة من جزيئات siRNA الضابطة السالبة المختلفة. وقد تم قياس دمج النيوكليوتيدات بفحص امتصاص بروموديوكسي يوريدين (BrdU)، وهو نظير قاعدي للثيميدين يحل محل الثيميدين أثناء تضاعف الحمض النووي ويُدمج في الحمض النووي المُصنَّع حديثًا. قد تشير التغيرات في معدلات تخليق الحمض النووي إلى تغير في نمو الخلية أو دورة الخلية. أظهرت الخلايا المُعدَّلة وراثيًا باستخدام جزيء siRNA الضابط السالب AllStars معدل دمج BrdU مشابهًا جدًا لمعدل الخلايا غير المُعدَّلة وراثيًا. ومع ذلك، أدى اختبار جزيء siRNA ضابط سالب آخر (الضابط 1) إلى تغيير في النمط مع انخفاض مستوى تخليق الحمض النووي، مما يشير إلى أن هذا الجزيء يؤثر على نمو الخلية أو دورة الخلية (انظر الشكل "النمط الظاهري الطبيعي لتخليق الحمض النووي").

استبعاد الصبغة من الخلايا الحية

استُخدم اختبار استبعاد الصبغة في الخلايا الحية لقياس التأثيرات السامة المحتملة لمجموعة من جزيئات siRNA الضابطة السلبية. أظهرت النتائج أن الخلايا المُعدَّلة وراثيًا باستخدام siRNA الضابط السلبي AllStars والخلايا غير المُعدَّلة وراثيًا احتوت على عدد مماثل من الخلايا الحية والميتة. في المقابل، أدت جزيئات siRNA الضابطة السلبية الأخرى إلى زيادة في السمية الخلوية (انظر الشكل "لا زيادة في التأثيرات السامة").

تلوين الحمض النووي لتحليل دورة الخلية

استُخدم تلوين الحمض النووي بعد تثبيت الخلايا لقياس توزيع دورة الخلية (عدد الخلايا في أطوار G1/G0 وS وG2 من دورة الخلية). بعد نقل جزيئات siRNA الضابطة السلبية AllStars، كانت نسبة الخلايا في كل طور مماثلة لتلك الملاحظة في الخلايا غير المنقولة (انظر الشكل "توزيع دورة الخلية الطبيعي"). تُظهر هذه النتيجة أن جزيئات siRNA الضابطة السلبية AllStars لا تؤثر سلبًا على دورة الخلية.

نقل بناء المراسل لتقييم الاندماج في RISC

لإجراء تجارب دقيقة للتحكم السلبي في تثبيط التعبير الجيني باستخدام تقنية RNAi، يجب دمج جزيء siRNA الخاص بالتحكم السلبي في مركب RISC (مركب إسكات الجينات المُحفز بواسطة RNA). هذا يعني أن جزيء siRNA الخاص بالتحكم يمر بنفس العملية البيولوجية التي يمر بها جزيء siRNA المُستهدف للجين، مما يُتيح مقارنة البيانات المُستقاة من جزيء siRNA المُستهدف للجين مع البيانات المُستقاة من جزيء siRNA الخاص بالتحكم السلبي، وذلك لتحديد النتائج الناتجة عن تثبيط الجين المستهدف بدقة.

أُجريت التجارب على النحو التالي.

مبدأ

يُعدّ نقل جزيء siRNA للتحكم السلبي ضروريًا في كل تجربة RNAi. يجب مقارنة نتائج التحكم السلبي بنتائج الخلايا غير المنقولة. من المفترض أن يكون التعبير الجيني والنمط الظاهري متشابهين في كل من الخلايا غير المنقولة والخلايا المنقولة بجزيء siRNA للتحكم السلبي. في حال ملاحظة أي تغيير في التعبير أو النمط الظاهري في الخلايا المنقولة بجزيء siRNA للتحكم السلبي، فإن هذه التغييرات غير نوعية، وتعود إلى إجراءات النقل أو سمية siRNA، وليس إلى تكامل التسلسل. يجب أن تكون التأثيرات غير النوعية في حدها الأدنى لضمان نتائج موثوقة لتقنية RNAi/miRNA.

يمكن أيضًا مقارنة نتائج العينة الضابطة السلبية بنتائج الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير/الميكروي (siRNA/miRNA) الخاص بالجين قيد الدراسة. تُمكّن هذه المقارنة الباحث من تحديد تأثيرات تثبيط الجين المستهدف على التعبير الجيني والنمط الظاهري، لأن عينة التحكم السلبية خضعت لنفس العملية البيولوجية، مع اختلاف تسلسل الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير/الميكروي فقط.

إجراء

- قارن النتائج مع نتائج الخلايا غير المعدلة وراثيًا لتحديد ما إذا كان الإعداد التجريبي يسبب تأثيرات غير محددة
- قارن النتائج مع نتائج siRNA الخاص بالجين لتحديد تأثيرات تثبيط الجين المستهدف
- في تجارب محاكاة الحمض النووي الريبوزي الميكروي (miRNA)، قارن النتائج مع نتائج محاكاة الحمض النووي الريبوزي الميكروي الخاصة بالجينات لتحديد تأثيرات خفض تنظيم الهدف.

يمكن استخدام نتائج اختبار AllStars Negative Control siRNA على النحو التالي:

التطبيقات

- جميع تجارب التداخل الرناوي الروتينية
- تجارب بدء التشغيل بتقنية RNAi
- فحص RNAi عالي الإنتاجية
- تجارب تتضمن نقل جزيئات miRNA المحاكية