كياجين، 150043، طقم ميدي ريبلي جي (25)

بوليميراز الحمض النووي، والمحاليل المنظمة، والكواشف اللازمة لـ 25 تفاعل تضخيم جينوم كامل بحجم 50 ميكرولتر (الناتج النموذجي 40 ميكروغرام لكل تفاعل)

سمات

- يمكن استخدام الحمض النووي المُضخّم في تطبيقات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) والمصفوفات الدقيقة وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- تضخيم الإزاحة المتعددة متساوي الحرارة (MDA) باستخدام بوليميراز الحمض النووي المصحح
- ينتج عن تضخيم الجينوم الكامل (WGA) من 7 إلى 40 ميكروغرام من الحمض النووي المضخم من 10 نانوغرام من الحمض النووي
- صيغة فائقة السرعة لتضخيم الجينوم الكامل في غضون ساعة إلى ساعة ونصف
- تنسيق عالي الإنتاجية لـ 96 عينة مع وقت معالجة لا يتجاوز 20 دقيقة

تفاصيل المنتج

يمكن التغلب على القيود المفروضة على عدد وأنواع التحليلات الجينومية التي يمكن إجراؤها بسبب عدم كفاية كميات الحمض النووي الجينومي، وذلك من خلال التضخيم الشامل لجميع الحمض النووي داخل العينة (تضخيم الجينوم الكامل). توفر مجموعات REPLI-g بوليميراز الحمض النووي، والمحاليل المنظمة، والكواشف اللازمة لتضخيم الجينوم الكامل بشكل متجانس للغاية مع أدنى حد من التحيز التسلسلي، ويمكن استخدامها مع مواد أولية متنوعة، بما في ذلك الحمض النووي الجينومي، والدم الطازج أو المجفف، ومسحات الخد، والأنسجة والخلايا الطازجة أو المجمدة. تتوفر مجموعات QIAGEN REPLI-g بأحجام وتكوينات مختلفة، مما يتيح للباحثين تصميم أفضل سير عمل يناسب تطبيقهم ومساحة مختبرهم. تتراوح كمية الحمض النووي المُضخّم في مجموعات REPLI-g عادةً من 7 إلى 40 ميكروغرامًا تقريبًا، وذلك حسب المجموعة المستخدمة وسير العمل المُتبع.

توفر مجموعتا REPLI-g Mini وMidi عمليةً بسيطةً باستخدام أنبوب واحد مع إنتاجية أعلى من الحمض النووي المُضخّم، بينما تُمكّن مجموعة REPLI-g UltraFast من تضخيم الجينوم الكامل بدقة عالية وتجانس تام في غضون 60-90 دقيقة فقط. وللمعالجة عالية الإنتاجية في تنسيق 96 بئرًا، تتيح مجموعة REPLI-g Screening Kit، بفضل إجراءاتها المُبسّطة التي تتم في درجة حرارة الغرفة، التعامل مع السوائل بسهولة في غضون 20 دقيقة فقط. صُممت مجموعة REPLI-g Screening Kit للفحص السريع باستخدام مجموعة من تقنيات تحديد النمط الجيني، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتسلسل، أو تحليل المصفوفات الدقيقة.

أداء

إنتاجية عالية من مجموعة متنوعة من العينات، مناسبة للعديد من التطبيقات

يمكن استخدام عينات بحثية سريرية وغير سريرية متنوعة مع مجموعات REPLI-g Mini وMidi، بما في ذلك الحمض النووي الجينومي، والدم الطازج أو المجفف، والأنسجة والخلايا الطازجة أو المجمدة. تصل كمية الحمض النووي المُستخلصة لكل تفاعل بحجم 50 ميكرولتر إلى 10 ميكروغرام (المجموعة المصغرة) أو 40 ميكروغرام (المجموعة المتوسطة) (انظر الشكل "كمية ثابتة من الحمض النووي باستخدام أي نوع من العينات")، بينما يتم عادةً الحصول على كمية موحدة من الحمض النووي المُضخّم بغض النظر عن كمية الحمض النووي القالب (انظر الشكل "كمية موحدة من الحمض النووي من كميات مختلفة من القالب"). يُعد الحصول على كمية موحدة من الحمض النووي من تراكيز مختلفة للقالب أمرًا بالغ الأهمية دائمًا، ولكنه ضروري بشكل خاص للتطبيقات عالية الإنتاجية، والتي تتطلب إمكانية إجراء تحليلات جينية لاحقة دون الحاجة إلى قياس أو تعديل إضافي لتركيز الحمض النووي.

يبلغ متوسط ​​إنتاج الحمض النووي من مجموعة REPLI-g UltraFast Mini Kit من 7 إلى 10 ميكروغرام لكل 20 ميكرولتر من التفاعل خلال 90 دقيقة باستخدام عينات ذات جودة قياسية. في حال ضيق الوقت، يتوفر ناتج كافٍ لإجراء التحليل الجيني اللاحق بعد 45 دقيقة فقط (انظر الشكل "إنتاجية عالية وثابتة للحمض النووي المُضخّم"). لا يتم تضخيم عينات التحكم السلبية (بدون الحمض النووي القالب)، مما يوفر مؤشرًا موثوقًا لوجود/عدم وجود الحمض النووي في العينة أو الحمض النووي الملوث (انظر الشكل "إنتاجية عالية وثابتة للحمض النووي المُضخّم").

عادةً ما ينتج عن تفاعل مجموعة REPLI-g Screening Kit كمية 8 ميكروغرام من الحمض النووي لكل 40 ميكرولتر من التفاعل. يمكن استخدام الحمض النووي المُضخّم مباشرةً في العديد من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تحديد النمط الجيني (مثل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة، وتكرارات التتابع القصيرة، والحذف والإدخال)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، والمصفوفات الدقيقة، والتسلسل. على عكس إجراءات تضخيم الجينوم الكامل الأخرى التي تتطلب تحضير التفاعل على الجليد، تستخدم مجموعة REPLI-g Screening Kit درجة حرارة الغرفة مع 20 دقيقة فقط من وقت المعالجة، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لمعالجة عينات متعددة بالتوازي. يُعد الحصول على كميات متجانسة من الحمض النووي من تراكيز مختلفة للقالب أمرًا بالغ الأهمية لتطبيقات الإنتاجية العالية، مما يسمح بإجراء التحليل الجيني اللاحق دون الحاجة إلى قياس تركيز الحمض النووي أو تعديله. عادةً ما يكون متوسط ​​طول المنتج أكبر من 10 كيلوبايت، ويتراوح بين 2 كيلوبايت و100 كيلوبايت (انظر الشكل "كمية متجانسة من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي").

يبلغ متوسط ​​طول ناتج تضخيم الحمض النووي بتقنية REPLI-g عادةً أكثر من 10 كيلوبايت، ويتراوح بين 2 و100 كيلوبايت، مما يتيح إجراء تطبيقات لاحقة مثل تحليل إنزيمات التقييد المعقدة وتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى. يُعد الحمض النووي المُضخّم بتقنية REPLI-g مناسبًا للغاية لتطبيقات التنميط الجيني، مثل التنميط الجيني للنيوكليوتيدات المفردة المتغيرة (SNP) باستخدام مجموعات بادئات/مجسات TaqMan® (انظر الشكل "التنميط الجيني الموثوق للنيوكليوتيدات المفردة المتغيرة")، والتسلسل، وتحليل التكرارات الترادفية القصيرة/الميكروساتلايت (انظر الشكل "التنميط الجيني الدقيق").

ملاحظات الباحثين

"خلال العامين الماضيين، استخدمنا مجموعة REPLI-g Ultra Fast Mini Kit على نطاق واسع في العديد من المشاريع. وقد مكّننا تضخيم الإزاحة المتعددة باستخدام هذه المجموعة من تضخيم جميع منتجات الحمض النووي بدقة عالية وبمعدل خطأ منخفض للغاية وتغطية واسعة. تشمل التطبيقات اللاحقة التي استخدمنا فيها هذه المجموعة تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) في أغلب الأحيان، بالإضافة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتقنية المصفوفات الدقيقة. علاوة على ذلك، نعمل على تطبيق هذه التقنية في أنظمة الموائع الدقيقة أو أنظمة المختبر على رقاقة، نظرًا لأن هذه الطريقة لا تتطلب برنامجًا معقدًا للدورات الحرارية." د. رونغ فان، أستاذ مساعد في الهندسة الطبية الحيوية، جامعة ييل، الولايات المتحدة الأمريكية.

تم استخدامه بنجاح في تقنيات التسلسل الجيني من الجيل التالي

أظهرت العديد من الدراسات نجاح استخدام الحمض النووي المُضخّم بتقنية REPLI-g في تطبيقات التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS)، بدءًا من تسلسل الإكسوم والجينوم الكامل للخلايا السرطانية، مرورًا بأبحاث الميتاجينوميات، وصولًا إلى تحليل الخلايا المفردة (للاطلاع على مجموعة من الدراسات الحديثة التي استخدمت REPLI-g بنجاح في NGS، يُرجى مراجعة صفحة موارد WGA). ونظرًا للجدل الدائر حول استخدام الحمض النووي المُضخّم للجينوم الكامل في تطبيقات NGS والمصفوفات، فقد رصدنا عوامل محتملة قد تؤثر على نجاح استخدام الحمض النووي المُضخّم في هذه التطبيقات اللاحقة. وقد تبيّن لنا أن جودة المادة المُدخلة تؤثر بشكل كبير على نجاح تجارب NGS اللاحقة. فعند استخدام حمض نووي منخفض الجودة (مثل الحمض النووي المتدهور) أو أنسجة قديمة، قد لا يُعطي الحمض النووي المُضخّم نتائج موثوقة (البيانات غير معروضة). ومع ذلك، يُظهر تحليل الجينوم الكامل، باستخدام تقنية REPLI-g، على خلايا سليمة أو حمض نووي نقي غير متدهور، أن نتائج NGS تُضاهي تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الحمض النووي الجينومي النقي. تشير مقارنة تغطية التسلسل ومحاذاة تسلسل المواقع الجينومية إلى انخفاض مستويات الحمض النووي غير الوظيفي بعد تضخيم الجينوم الكامل (WGA)، بينما تتراوح معدلات الخطأ ضمن نطاق نسبي مماثل لكل من الحمض النووي المُضخّم والحمض النووي الجينومي (انظر الشكل "نتائج تسلسل الجيل التالي (NGS) المتشابهة التي تم الحصول عليها باستخدام الحمض النووي الجينومي النقي أو الحمض النووي المُضخّم بتقنية REPLI-g"). تستخدم مجموعات مكتبات QIAseq FX Single Cell RNA وQIAseq FX Single Cell DNA تفاعل REPLI-g MDA للحصول على مكتبات NGS عالية الجودة عند البدء بكمية تتراوح بين 10 بيكوغرام و1 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) أو الحمض النووي (DNA).

تضخيم الجينوم الكامل عالي الدقة

تُوفر تقنية REPLI-g تضخيمًا متجانسًا للغاية للحمض النووي عبر الجينوم بأكمله. يستطيع بوليميراز Phi29 مضاعفة ما يصل إلى 70 كيلوبايت دون الانفصال عن قالب الحمض النووي الجينومي (انظر الشكل "تمثيل تخطيطي لتضخيم REPLI-g"). على عكس تقنيات تضخيم الجينوم الكامل (WGA) القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتميز بوليميراز Phi29 بنشاط تصحيحي خارجي من 3' إلى 5'، ويحافظ على دقة أعلى تصل إلى 1000 ضعف مقارنةً ببوليميراز Taq DNA أثناء التضاعف. تضمن البادئات المقاومة للإكسونوكلياز، والمُرفقة في المجموعة، إنتاجية عالية من الحمض النووي، كما تم تحسين نظام مُخزن WGA لضمان طول قراءة كبير جدًا وتمثيل غير متحيز للمواقع.

يتفوق REPLI-g على طرق تضخيم الجينوم الكامل القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تشمل الطرق التقليدية لتضخيم الحمض النووي الجينومي عمليةً تستغرق وقتًا طويلاً لإنشاء سلالات خلايا مُحوَّلة بفيروس إبشتاين-بار، تليها عملية تضخيم الجينوم الكامل باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المُحفَّز بأوليغونوكليوتيدات عشوائية أو مُتَغَيِّرة. كما أن الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (مثل DOP-PCR وPEP)، الشائعة الاستخدام لدى موردين آخرين، قد تُنتج شوائب تضخيم غير مُحدَّدة وتُغطي المواقع الجينية بشكل غير كامل. في بعض الحالات، قد ينتج حمض نووي بطول أقل من 1 كيلوبايت، وهو غير صالح للاستخدام في العديد من التطبيقات اللاحقة. بشكل عام، ينتج الحمض النووي بمعدل طفرات أعلى بكثير بسبب استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq ذي الدقة المنخفضة، مما قد يؤدي إلى تضخيم مُعرَّض للأخطاء، ينتج عنه، على سبيل المثال، طفرات في زوج قاعدي واحد، وانكماشات وتوسعات في تكرارات التتابع القصيرة المترادفة (STR). وعلى النقيض من هذه العيوب، يوفر REPLI-g تضخيمًا موحدًا للغاية عبر الجينوم بأكمله، مع الحد الأدنى من التحيز الموضعي وتقليل معدلات الطفرات أثناء التضخيم (انظر الشكلين "التضخيم عالي التمثيل باستخدام تقنية REPLI-g" و "تضخيم الجينوم الكامل المتسق والدقيق").

مبدأ

مبدأ التضخيم

غالبًا ما تكون كمية الحمض النووي الجينومي غير كافية لإجراء التحليل الجينومي، مما يحد من التحليلات الممكنة. تتغلب تقنية تضخيم الجينوم الكامل (WGA) على هذا القيد من خلال تضخيم الجينوم بأكمله داخل العينة، مما يوفر كميات كافية لإجراء جميع التحليلات على نفس عينة الحمض النووي. توفر تقنية REPLI-g تضخيمًا متجانسًا للغاية للحمض النووي عبر الجينوم بأكمله مع أدنى حد من التحيز التسلسلي.

تعتمد هذه الطريقة على تقنية تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA)، التي تستخدم تضخيم الجينوم متساوي الحرارة مع بوليميراز Phi 29 الفريد من نوعه، القادر على نسخ ما يصل إلى 100 كيلوبايت دون الانفصال عن قالب الحمض النووي الجينومي (انظر الشكل "تقنية تضخيم الإزاحة المتعددة [MDA]"). يُستخدم بوليميراز Phi 29 بوجود بادئات مقاومة للإكسونوكلياز لتحقيق إنتاجية عالية من الحمض النووي، ويتميز بنشاط تصحيحي للإكسونوكلياز من 3' إلى 5' بدقة أعلى بألف مرة من بوليميراز Taq، مما يحافظ على دقة عالية أثناء النسخ. وبفضل نظام REPLI-g المُحسَّن والفريد، يحل بوليميراز Phi 29 بسهولة البنى الثانوية مثل حلقات الدبوس، مما يمنع انزلاق البوليميراز وتوقفه وانفصاله أثناء التضخيم. وهذا يتيح توليد أجزاء من الحمض النووي تصل إلى 100 كيلوبايت بدون تحيز في التسلسل (انظر الشكل "التضخيم غير المتحيز باستخدام بوليميراز Phi 29").

التمسخ القلوي للحمض النووي

يجب فصل سلسلتي الحمض النووي الجينومي قبل استخدامه في إجراءات التضخيم الإنزيمي، وهو ما يتم غالبًا باستخدام طرق قاسية مثل الحضانة في درجات حرارة مرتفعة (الحضانة الحرارية) أو زيادة الرقم الهيدروجيني (الحضانة القلوية الكيميائية). تستخدم مجموعات REPLI-g حضانة قلوية لطيفة، مما يسمح بفصل سلسلتي الحمض النووي بشكل موحد مع تفتت منخفض جدًا أو تكوين مواقع خالية من القواعد. ينتج عن ذلك حمض نووي مُضخّم ذو سلامة عالية جدًا، ويزيد من طول القطع المُضخّمة بحيث يتم تمثيل المواقع والتسلسلات الجينومية بشكل موحد. مع مجموعات REPLI-g، يتم ضمان نتائج موثوقة دون بيانات إيجابية أو سلبية خاطئة في التطبيقات اللاحقة، على عكس تقنيات تضخيم الجينوم الكامل الأخرى التي تستخدم الفصل الحراري الذي يمكن أن يُتلف الحمض النووي القالب، مما يؤدي إلى مواقع متحيزة وغير ممثلة بشكل كافٍ (انظر الشكل "تأثير الفصل الحراري والقلوي على تمثيل المواقع").

إجراء

خلية REPLI-g المفردة: REPLI-g Mini
المادة الأولية: خلايا مفردة، الحمض النووي الجينومي
كمية المدخلات: خلايا مفردة، 2-1000 خلية، نسيج، حمض نووي جينومي نقي (1-10 نانوغرام)
الناتج (ميكروغرام/تفاعل): 40
زمن التفاعل: 8-16 ساعة
مدة التدريب العملي: 15 دقيقة
التنسيق: أنبوب

تستخدم مجموعات REPLI-g Mini وMidi طريقةً بسيطةً وموثوقةً لتحقيق تضخيم دقيق للجينوم من كميات صغيرة من الحمض النووي الجينومي المستهدف المعزول، أو مباشرةً من الدم الكامل، أو شرائح الدم المجففة، أو الطبقة البيضاء، أو خلايا زراعة الأنسجة (انظر الشكل "إجراء REPLI-g Mini وMidi"). تُضاف محلول التحلل، الذي يُحلل مادة العينة ويُغير طبيعة الحمض النووي، ثم تُحضن العينات لمدة دقيقة واحدة (انظر الشكل "إجراء REPLI-g Mini وMidi"). بعد معادلة المحلول، يُضاف المزيج الرئيسي (بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي REPLI-g Mini) ويستمر تفاعل التضخيم متساوي الحرارة طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. يمكن تخزين الحمض النووي المُضخم بواسطة REPLI-g على المدى الطويل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية دون أي آثار سلبية (انظر الشكل "ثبات طويل الأمد").

تتضمن عملية تضخيم الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة REPLI-g UltraFast Mini Kit ثلاث خطوات أساسية (انظر الشكل "إجراء تنقية الحمض النووي الجينومي"). أولًا، تُخضع العينة (10 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي المنقى، أو 0.5 ميكرولتر من الدم الكامل، أو 300 خلية من خلايا زراعة الأنسجة) لعملية تمسخ قلوية لطيفة، لتجنب تفتت الحمض النووي القالب وتلفه. بعد ذلك، تُعادل العينة، ثم تُحضن مع إنزيم بوليميراز الحمض النووي REPLI-g UltraFast عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. يصبح الحمض النووي المُضخّم جاهزًا للاستخدام بعد 60 دقيقة دون الحاجة إلى مزيد من التنقية.

تتميز طريقة REPLI-g Screening بالسرعة والبساطة والدقة العالية، وهي قادرة على تضخيم عدة عينات جينومية بالتوازي، كما هو موضح في دليل REPLI-g Screening Handbook. يتم تحليل العينة وفصل سلسلتي الحمض النووي عن طريق حضنها مع محلول SB1 عند درجة حرارة 65 درجة مئوية. يتم إيقاف عملية الفصل بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة. يُضاف محلول SB2 وإنزيم بوليميراز الحمض النووي، ويستمر التضخيم متساوي الحرارة لمدة 10 ساعات على الأقل أو طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية.

تُجرى جميع مراحل التفاعل في درجة حرارة الغرفة، مما يُسهّل استخدامها مع أجهزة مناولة السوائل. يستغرق تحضير 96 عينة 20 دقيقة فقط، مما يوفر الوقت للتركيز على مهام أخرى مهمة. تجمع مجموعة أدوات فحص REPLI-g بين عدد من الميزات التي تجعلها مناسبة للغاية للاستخدام في الفحص اليدوي أو الآلي عالي الإنتاجية للطفرات، بما في ذلك خطوات سحب كميات كبيرة من السوائل لزيادة الدقة، والتوافق مع الصفائح الدقيقة ذات 96 بئرًا، وبروتوكول مُبسّط لإعداد سريع وسهل (انظر مخطط "إجراء فحص REPLI-g").

اختر مجموعة REPLI-g الأنسب لمتطلباتك الخاصة من مجموعتنا الكاملة من منتجات REPLI-g المخصصة (انظر الجدول "مواصفات مجموعة واسعة من مجموعات REPLI-g").

التطبيقات

- يمكن استخدام تقنية REPLI-g لتضخيم الجينوم في مجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك:
- تحديد النمط الجيني للنيوكليوتيدات المفردة باستخدام مجموعات البادئات/المجسات TaqMan®
- الكشف عن الطفرات باستخدام تقنية qPCR وتقنية PCR
- تقنية التسلسل من الجيل التالي
- تحليل STR/الميكروساتلايت
- تسلسل سانجر
- تحليل RFLP و Southern blot
- تقنيات المصفوفات، مثل التهجين الجينومي المقارن