Qiagen، 150065، مجموعة خلايا مفردة REPLI-g WTA (96)

بوليميراز الحمض النووي REPLI-g SensiPhi، والمحاليل المنظمة، والكواشف لـ 96 × 60 ميكرولتر من تفاعلات تضخيم النسخ الكاملة (العائد النموذجي: 20 ميكروغرام)

سمات

- تغطية كاملة للمستنسخات من خلايا مفردة فقط
- توزيع موحد لنقاط التسارع مع تحيز تسلسلي ضئيل بفضل تقنية MDA
- مُحسَّن للاستخدام مع التقنيات الجديدة، بما في ذلك تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS).
- تضخيم الحمض النووي الريبي الكلي أو الحمض النووي الريبي الغني بالحمض النووي الريبي الرسول (متعدد الأدينين)
- أداة جديدة لأبحاث السرطان والخلايا الجذعية

أداء

مادة العينة (الخلايا/الحمض النووي الريبي الكلي): مجال البحث
الإنسان/الحيوان: أبحاث المؤشرات الحيوية (التعبير الجيني)
أبحاث الخلايا الجذعية
تحليل الخلايا الجنينية المنتشرة
دراسات الفسيفساء
دراسات الاستعداد الوراثي
تصنيف الحيوانات المعدلة وراثيًا
السرطان: تحليل المتغيرات الجينية الجسدية
تطور الورم
الخلايا الجذعية السرطانية/التطور
تحليل الخلايا السرطانية المنتشرة

تغطية كاملة للمستنسخات، مع تباين تجريبي منخفض

عدد كبير من القراءات يرتبط بالحمض النووي الريبوزي المشفر للبروتين

الكشف الموثوق عن النسخ منخفضة الوفرة

للاستخدام في مجموعة واسعة من التطبيقات ومجالات البحث

مبدأ

تخضع جميع الإنزيمات ومكونات التضخيم في المجموعة لإجراء تطهير فريد ومُحكم لضمان التخلص من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الملوث القابل للتضخيم بواسطة REPLI-g. بعد هذه العملية، تخضع المجموعات لرقابة صارمة على الجودة لضمان عملها بكفاءة تامة.
- يعمل محلول التحلل المبتكر على تثبيت الحمض النووي الريبوزي الخلوي بشكل فعال. وهذا يضمن أن يعكس الحمض النووي الريبوزي الناتج بدقة نمط التعبير الجيني في الجسم الحي.
- تم تطوير جميع الخطوات الإنزيمية خصيصاً لتمكين المعالجة الفعالة للحمض النووي الريبوزي (RNA) من أجل تضخيم دقيق. على سبيل المثال، تشمل هذه العمليات إزالة الحمض النووي الجينومي (gDNA) بشكل فعال قبل تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA).
يُستخدم إنزيم بوليميراز الحمض النووي REPLI-g SensiPhi الجديد في تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA). وهو إنزيم مُطوَّر حديثًا ذو ألفة عالية يرتبط بالحمض النووي التكميلي (cDNA) بكفاءة أكبر، خاصةً عندما يكون تركيز الحمض النووي التكميلي منخفضًا في مزيج التفاعل. إضافةً إلى ذلك، وعلى عكس الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتميز إنزيم بوليميراز الحمض النووي REPLI-g SensiPhi بنشاط تدقيق قوي يُقلل الأخطاء بمقدار 1000 ضعف. كما يتميز بنشاط إزاحة قوي للسلسلة، مما يُتيح تكرار الحمض النووي التكميلي من خلال هياكل حلقية مستقرة مقاومة لإجراءات تضخيم الجينوم الكامل أو النسخ الجيني الكامل القائمة على إنزيم Taq.

مكونات فريدة من نوعها لمجموعة خلايا REPLI-g WTA المفردة

إجراء

- تحلل الخلايا: يتم تحلل عينة من خلية واحدة (تحتوي على 1-1000 خلية) بكفاءة خلال 5 دقائق، دون أي تأثير على سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA). تُستخدم العينة المتحللة لتحليل الحمض النووي الريبوزي الكلي (WTA) أو، اختيارياً، الحمض النووي الريبوزي المُخصب بالحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) (poly A+).
- توليد الحمض النووي التكميلي (cDNA): بعد تحلل الخلايا، يُزال الحمض النووي الجينومي (gDNA) قبل عملية تضخيم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (WTA)، لأن القياس الدقيق لمستويات النسخ يعتمد على استبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن تلوث الحمض النووي الجينومي. وبحسب البادئ المُختار خلال تفاعل النسخ العكسي اللاحق، سيتم تضخيم جميع النسخ (في حال إجراء إثراء الحمض النووي الريبوزي الكلي باستخدام بادئات عشوائية وبادئات قليلة النوكليوتيدات dT) أو النسخ متعددة الأدينين فقط (في حال إجراء إثراء الحمض النووي الريبوزي الرسول متعدد الأدينين باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات dT). وبالتالي، سيحتوي التفاعل على مزيج من البادئات العشوائية وبادئات قليلة النوكليوتيدات dT، أو بادئات قليلة النوكليوتيدات dT فقط، مما يقلل من تضخيم الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) ويضمن نسخ نهايات 3' من الحمض النووي التكميلي (يتراوح حجم النسخ بين 700 و1000 زوج قاعدي تقريبًا).
- الربط: يتم ربط الحمض النووي التكميلي المُصنّع باستخدام مزيج ربط عالي الكفاءة. ونظرًا لطبيعة تفاعل الربط اللاحق، لا تتجمع شظايا الحمض النووي التكميلي بالترتيب الذي كانت عليه في الأصل داخل الخلية. ومع ذلك، لا يؤثر هذا على الكشف عن تسلسلات الأحماض النووية، مثل مناطق الربط، في التطبيقات اللاحقة مثل التسلسل الجيني عالي الإنتاجية (NGS) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
- تضخيم النسخ الكامل: يتم تضخيم الحمض النووي التكميلي المربوط باستخدام تقنية MDA، مع بوليميراز الحمض النووي REPLI-g SensiPhi الجديد، في تفاعل متساوي الحرارة يستمر لمدة ساعتين.

- يقوم بروتوكول "تضخيم المناطق 3' من mRNA (Poly A+) من الخلايا المفردة" بتضخيم mRNAs (وأنواع أخرى من RNAs) ذات ذيول poly A+ فقط وهو مناسب للغاية لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك NGS (RNA-Seq) و PCR في الوقت الحقيقي وتحليل المصفوفات الدقيقة.
يُضخّم بروتوكول "تضخيم الحمض النووي الريبوزي الكلي من الخلايا المفردة" كامل النسخ الجيني، بما في ذلك الحمض النووي الريبوزي مع وبدون ذيول متعددة الأدينين، والحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (lncRNA)، والحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل جدًا (lincRNA). تجدر الإشارة إلى أن الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (rRNA) يُضخّم أيضًا، وسيكون موجودًا بمستوى عالٍ بعد التضخيم. عند استخدام مجسات مُحددة التسلسل، كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو المصفوفات، لن يؤثر الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي المُضخّم على نتائج التطبيقات اللاحقة. عند استخدام الحمض النووي الريبوزي المُضخّم لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq)، يجب الانتباه إلى أن أكثر من 90% من القراءات مُشتقة من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي؛ لذا يجب الحصول على عدد كافٍ من القراءات عند إجراء تسلسل كامل النسخ الجيني.
- تم تحسين بروتوكول "تضخيم الحمض النووي الريبي النقي" لتضخيم النسخ الكامل من قوالب الحمض النووي الريبي الكلي أو المخصب وهو مناسب للغاية لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التسلسل الجيني من الجيل التالي، والتفاعل التسلسلي للبوليميراز في الوقت الحقيقي، وتحليل المصفوفات الدقيقة.

التطبيقات

- mRNA ذو ذيول متعددة الأدينين
- الحمض النووي الريبي الكلي
- جميع مناطق نسخ الحمض النووي الريبوزي
- نهايات 3' من الحمض النووي الريبوزي الرسول
- الحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (lnc) والحمض النووي الريبوزي غير المشفر الطويل (linc RNA)

- الحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNA) والحمض النووي الريبوزي الميكروي (miRNA)

تتيح مجموعة REPLI-g WTA Single Cell Kit تضخيمًا موحدًا لجميع النسخ من عينات صغيرة جدًا، مما يُمثل بدقة نمط النسخ لخلية واحدة مع تحيز تضخيم محدود للغاية، أو معدوم. وبحسب البروتوكول المُستخدم، يُعد الحمض النووي التكميلي المُضخّم مناسبًا جدًا للاستخدام في تقنيات التسلسل الجيني من الجيل التالي (RNA-Seq)، أو مصفوفات التعبير الجيني، أو لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).

يمكن استخدام مجموعة REPLI-g WTA Single Cell Kit لتضخيم النسخ الجيني الكامل لتحليل ما يلي:

لا يُناسب استخدامه مع الأحماض النووية الصغيرة (على سبيل المثال):