شركة كياجين، 150345، مجموعة خلايا مفردة REPLI-g (96)

بوليميراز REPLI-g sc، والمحاليل المنظمة، والكواشف لـ 96 تفاعل تضخيم جينوم كامل (ينتج ما يصل إلى 40 ميكروغرام/تفاعل)

سمات

- تضخيم الجينوم الكامل من مادة الخلية الواحدة مع تغطية جينومية كاملة
- تضخيم غير متحيز للمواقع الجينومية بفضل تقنية MDA
- مُحسَّن للاستخدام مع التقنيات الجديدة، بما في ذلك تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS).
- إنتاجية ثابتة تصل إلى 40 ميكروغرام (متوسط ​​طول المنتج >10 كيلوبايت)
- أداة جديدة لأبحاث السرطان، وأبحاث الخلايا الجذعية، أو علم الجينوم البيئي

تفاصيل المنتج

غالبًا ما يكون تحليل تسلسل الحمض النووي وتحديد النمط الجيني للعينات البيولوجية باستخدام أجهزة مبتكرة، مثل منصات التسلسل من الجيل التالي (NGS)، محدودًا بسبب صغر كمية العينة المتاحة. صُممت مجموعة REPLI-g Single Cell Kit خصيصًا لتضخيم الحمض النووي الجينومي بشكل موحد من الخلايا المفردة (من خلية واحدة إلى أقل من 1000 خلية بكتيرية أو ورمية) أو الحمض النووي الجينومي النقي مع تغطية كاملة للجينوم. تتوفر أيضًا بروتوكولات إضافية للاستخدام مع الدم الطازج أو المجفف أو الأنسجة الطازجة أو المجمدة. تخضع المحاليل والكواشف المخصصة لإجراء تطهير فريد ومضبوط لتجنب تضخيم الحمض النووي الملوث، مما يضمن نتائج موثوقة للغاية في كل مرة. يتم تحقيق تضخيم دقيق للجينومات مع تحيز تسلسلي ضئيل وبدون فقدان للجينوم باستخدام تقنية التضخيم المتعدد للإزاحة (MDA) المبتكرة. على عكس تقنيات تضخيم الجينوم الكامل (WGA) القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يتم زيادة معدلات الدقة العالية حتى 1000 ضعف، مما يجنب النتائج الإيجابية أو السلبية الكاذبة المكلفة.

أداء

مادة العينة (الخلايا/الحمض النووي): مجال البحث
الإنسان/الحيوان: أبحاث المؤشرات الحيوية (تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة، الطفرات، تغيرات عدد النسخ)
أبحاث الخلايا الجذعية
تحليل الخلايا الجنينية المنتشرة
دراسات الفسيفساء
دراسات الاستعداد الوراثي
تصنيف الحيوانات المعدلة وراثيًا
السرطان: تحليل المتغيرات الجينية الجسدية
تطور الورم
الخلايا الجذعية السرطانية/التطور
تحليل الخلايا السرطانية المنتشرة
البكتيريا: دراسات الميتاجينوم
تحليل مسببات الأمراض
التنميط الجيني للميكروبات
النباتات*: أبحاث الثغور
تحليل حبوب اللقاح

تغطية جينومية كاملة، مناسبة للغاية لتقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) والتطبيقات اللاحقة الأخرى.

يتميز الحمض النووي المُضخّم باستخدام مجموعة REPLI-g Single Cell Kit بمتوسط ​​طول منتج يزيد عن 10 كيلوبايت، مع تغطية جينومية مُثلى. وقد تم اختباره، وهو مناسب للغاية للعديد من التحليلات اللاحقة، بما في ذلك التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS)، والتهجين الجينومي المقارن المصفوفي (aCGH)، والتطبيقات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (انظر الجدول 2). ونظرًا لعدم الحاجة إلى خطوة تضخيم منفصلة تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل، فإن تضخيم الجينوم الكامل وإعداد المكتبة باستخدام REPLI-g يتطلبان وقتًا أقل للمعالجة اليدوية، وينتج عنهما قراءات أطول مقارنةً بالطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر الشكل "التسلسل الجيني من الجيل التالي باستخدام الحمض النووي المُضخّم بواسطة REPLI-g يتطلب وقتًا أقل للمعالجة اليدوية، ويُنتج معلومات تسلسلية أكثر من الطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل"). تم الحصول على نتائج تسلسل الجيل التالي (NGS) عالية الجودة وقابلة للمقارنة، تُظهر نسبة تغطية تسلسلية عالية ومعدلات خطأ منخفضة للغاية، باستخدام كلٍ من الحمض النووي الجينومي النقي أو الحمض النووي المُضخّم بتقنية REPLI-g Single Cell، حتى عند البدء من خلية بكتيرية واحدة فقط (انظر الشكل "نتائج NGS قابلة للمقارنة"). وتؤكد هذه النتائج دراسة تحليلية شاملة لمجموعة واسعة من المؤشرات التي تغطي جميع الكروموسومات الجسدية البشرية والكروموسوم X، حيث أثبتت ثلاث تجارب مستقلة مختلفة نجاح تضخيم الحمض النووي من جميع مناطق الجينوم دون أي فقدان للتسلسل (انظر الشكل "تغطية الجينوم الكاملة").

تتفوق مجموعة REPLI-g Single Cell Kit على مجموعات من موردين آخرين

تُنتج طرق تضخيم الجينوم الكامل (WGA) القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، كما هو شائع لدى الموردين الآخرين، شظايا قصيرة تنتهي بتسلسلات بادئات PCR، مما قد يؤثر على العمليات اللاحقة (مثل التسلسل الجيني من الجيل التالي؛ انظر الشكل "التسلسل الجيني من الجيل التالي باستخدام الحمض النووي المُضخّم بتقنية REPLI-g يتطلب وقتًا أقل ويُنتج معلومات تسلسلية أكثر من الطرق القائمة على PCR"). قد يؤدي تضخيم الجينوم الكامل القائم على PCR إلى تضخيم مُعرّض للخطأ، مما ينتج عنه، على سبيل المثال، طفرات في أزواج القواعد المفردة، وانكماشات وتوسعات في تكرارات التتابع القصيرة المترادفة (STR)، كما يؤدي أيضًا إلى مواقع جينية متحيزة وغير ممثلة تمثيلاً كافيًا بسبب استخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq ذي الدقة المنخفضة. في المقابل، توفر مجموعة REPLI-g Single Cell Kit تضخيمًا متجانسًا للغاية عبر الجينوم بأكمله، مع أدنى حد من التحيز الموضعي أثناء التضخيم. تم اختبار أربع مجموعات تضخيم جينوم كامل (WGA)، اثنتان منها تستخدمان تقنية تضخيم الحمض النووي المتعدد (MDA)، بما في ذلك مجموعة REPLI-g Single Cell Kit، وطريقتان تعتمدان على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وذلك للتحقق من تمثيل التسلسل وفقدان المواقع الجينية باستخدام بروتوكولات تضخيم الخلايا المفردة الخاصة بكل مجموعة. على عكس مجموعة REPLI-g Single Cell Kit، غالبًا ما فشلت الخلايا المفردة التي تم تحليلها باستخدام مجموعات من موردين آخرين في الحصول على تمثيل كامل وغير متحيز للتسلسل (انظر الشكل "تضخيم الحمض النووي غير المتحيز من خلية مفردة").

مبدأ

التطبيق: أجهزة القياس
تسلسل الجينوم الكامل: منصات التسلسل من الجيل التالي †
تسلسل الإكسوم
مصفوفات تحديد النمط الجيني للنيوكليوتيدات المفردة: منصات المصفوفات †
مصفوفة CGH
تقنيات qPCR/PCR: أجهزة تدوير PCR/PCR في الوقت الحقيقي †
تسلسل سانجر: أجهزة التسلسل الشعيرية †
التسلسل الناري: بايرومارك (كياجين)

تتضمن مجموعة REPLI-g Single Cell Kit إنزيم REPLI-g sc Polymerase، وهو تركيبة مُحسّنة من إنزيم Phi 29 polymerase المبتكر عالي الدقة، لتضخيم الحمض النووي الجينومي المعقد باستخدام تقنية التضخيم متعدد الإزاحة (MDA)، بالإضافة إلى حضانة قلوية لطيفة لضمان أدنى حد من تفتت الحمض النووي أو تكوين مواقع خالية من القواعد. صُممت هذه المجموعة خصيصًا لتوفير كميات كبيرة من الحمض النووي المُضخّم من الخلايا المفردة، مثل خلايا الأورام المعزولة أو البكتيريا (انظر الجدول 1). علاوة على ذلك، يمكن استخدامها مع عينات بحثية سريرية وغير سريرية متنوعة ومع الحمض النووي الجينومي النقي، كما تتوفر بروتوكولات إضافية للاستخدام مع الدم الطازج أو المجفف والأنسجة الطازجة أو المجمدة. تصل كميات الحمض النووي المُستخرجة عادةً إلى 40 ميكروغرامًا، بغض النظر عن كمية القالب الأولية، مما يعني إمكانية إجراء التحليلات الجينية اللاحقة دون الحاجة إلى قياس إضافي لتركيز الحمض النووي. يضمن متوسط ​​طول المنتج الذي يزيد عن 10 كيلوبايت والتغطية الكاملة للجينوم أن الحمض النووي المضخم باستخدام مجموعة REPLI-g Single Cell Kit مناسب للغاية للعديد من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك التسلسل من الجيل التالي (NGS)، والتهجين الجينومي المقارن القائم على المصفوفة (array CGH)، والتسلسل الناري، وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (الجدول 2).

مبدأ التضخيم

تستخدم مجموعة REPLI-g Single Cell Kit تقنية تضخيم الجينوم متساوي الحرارة، والمعروفة باسم تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA)، والتي تتضمن ارتباط سداسيات عشوائية بالحمض النووي المتفكك، يليها تخليق إزاحة السلسلة عند درجة حرارة ثابتة باستخدام شكل مُحسَّن من إنزيم بوليميراز Phi 29، الذي يتميز بخصائص إزاحة سلسلة قوية للغاية. تحدث أحداث تمهيد إضافية على كل سلسلة مُزاحة تعمل كقالب، مما يُتيح إنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي المُضخَّم (انظر الشكل "تقنية تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA)"). إنزيم بوليميراز Phi 29، وهو إنزيم مُشتق من العاثيات، هو بوليميراز حمض نووي ذو نشاط إكسونوكلياز 3'→5' (نشاط التدقيق) يُوفر دقة أعلى تصل إلى 1000 ضعف مقارنةً ببوليميراز Taq DNA. بفضل نظام التخزين المؤقت REPLI-g Single Cell الفريد والمُحسَّن، يقوم بوليميراز Phi 29 بحلّ البنى الثانوية بسهولة، مثل حلقات الدبوس، مما يمنع انزلاق البوليميراز وتوقفه وانفصاله أثناء التضخيم. وهذا يُتيح إنتاج شظايا DNA يصل طولها إلى 100 كيلوبايت دون تحيّز في التسلسل (انظر الشكل "تضخيم غير متحيز باستخدام بوليميراز Phi 29").

تحلل الخلايا وتشويه الحمض النووي في الوسط القلوي

يجب فصل سلسلتي الحمض النووي الجينومي قبل استخدامه في إجراءات التضخيم الإنزيمي، ويتم ذلك غالبًا باستخدام طرق قاسية مثل الحضانة في درجات حرارة مرتفعة (الحضانة الحرارية) أو زيادة الرقم الهيدروجيني (الحضانة القلوية الكيميائية). تستخدم مجموعة REPLI-g Single Cell Kit حضانة قلوية لطيفة، مما يسمح بتحلل الخلايا وفصل سلسلتي الحمض النووي الجينومي بشكل متجانس مع تفتت منخفض جدًا للحمض النووي أو توليد مواقع خالية من القواعد. ينتج عن ذلك حمض نووي مُضخّم ذو سلامة عالية جدًا، ويزيد من طول القطع المُضخّمة بحيث يتم تمثيل المواقع والتسلسلات الجينومية بشكل موحد (انظر الشكل "تأثير التفكيك الحراري والقلوي على تمثيل المواقع").

القضاء الفعال على تلوث الحمض النووي القابل للكشف

تخضع جميع مكونات مجموعة REPLI-g Single Cell Kit لإجراء تطهير فريد ومُحكم لضمان التخلص من جميع الحمض النووي الملوث القابل للتضخيم بواسطة REPLI-g. تُعرَّض المحاليل المنظمة والكواشف للأشعة فوق البنفسجية من خلال إجراء مبتكر وموحد لضمان عدم وجود أي بقايا قابلة للكشف من الحمض النووي الملوث (انظر الشكل "إجراء التطهير المبتكر"). بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية، تخضع المجموعات لرقابة صارمة على الجودة لضمان عملها بكفاءة تامة.

إجراء

مكونات المجموعة: المزايا
بوليميراز REPLI-g sc: قطع طويلة تصل إلى 70 كيلوبايت
دقة أعلى بألف مرة من Taq
تمثيل التسلسل الكامل
تضخيم متجانس لجميع المواقع
محلول تفاعل REPLI-g sc ‡: مُحسَّن لتضخيم غير متحيز وتمثيل جميع المواقع الجينية
محلول DLB (التحلل والتمسخ): تحضير فعال للتضخيم
عملية لا تُلحق الضرر بالحمض النووي
إجراء التطهير بالأشعة فوق البنفسجية: يضمن القضاء على التلوث المتبقي القابل للكشف بالحمض النووي

إجراء بسيط باستخدام أنبوب واحد

تستخدم مجموعة REPLI-g Single Cell Kit طريقة بسيطة وموثوقة لتحقيق تضخيم دقيق للجينوم من خلايا مفردة أو عينات محدودة. سهولة تحضير التفاعل ووقت المعالجة القصير جدًا (حوالي 15 دقيقة) يجعلان هذه الطريقة مباشرة وموثوقة (انظر الشكل "إجراءات مجموعة REPLI-g Single Cell Kit"). تم تطوير محاليل ومواد كيميائية مخصصة لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي من الخلايا المفردة، أو عينات الأنسجة المحدودة، أو الحمض النووي النقي، مع تمثيل كامل للتسلسل وتضخيم غير متحيز (الجدول 3). يمكن تخزين الحمض النووي المُضخّم بواسطة REPLI-g لفترة طويلة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية دون أي آثار سلبية (انظر الشكل "استقرار طويل الأمد").

التطبيقات

- تقنية التسلسل من الجيل التالي
- تحديد النمط الجيني للنيوكليوتيدات المفردة باستخدام مجموعات بادئات/مجسات TaqMan
- الكشف عن الطفرات باستخدام تقنية qPCR وتقنية PCR
- تحليل STR/الميكروساتلايت
- تسلسل سانجر
- التسلسل الناري
- تقنيات المصفوفات، مثل التهجين الجينومي المقارن (aCGH)

يمكن استخدام الحمض النووي المُضخّم باستخدام مجموعة REPLI-g Single Cell Kit في مجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك:

تعرف على المزيد حول منتجاتنا أحادية الخلية من خلال زيارة قسم موارد الخلايا المفردة لدينا.