مجموعة محلول منظم البلازميد الخالي من الإندو من شركة كياجين، 19048

المحاليل المنظمة P1، P2، P3، QBT، QC، QN، ER، TE، ماء خالٍ من السموم الداخلية، RNase A؛ لتحضير 10 نسخ ضخمة من البلازميد أو 5 نسخ ضخمة (خالية من السموم الداخلية)

سمات

- تم تحقيق أقل من 0.04 وحدة إندوتوكسين/ميكروغرام من الحمض النووي
- إزالة السموم الداخلية المتكاملة
- إنتاجية عالية من الحمض النووي البلازميدي عالي النسخ
- محلول LyseBlue لتحقيق التحلل الأمثل وأقصى إنتاجية للحمض النووي

تفاصيل المنتج

توفر مجموعات EndoFree Plasmid تنقيةً خاليةً من السموم الداخلية لحمض البلازميد النووي باستخدام التبادل الأيوني. تُمكّن خراطيش QIAfilter من تنقية المستخلص بسرعة عن طريق الترشيح. يتجاوز نقاء الحمض النووي المُنقّى نقاء الحمض النووي المُتحصّل عليه بواسطة الطرد المركزي المتدرج باستخدام كلوريد السيزيوم مرتين، وهو مناسب لتطبيقات النقل الجيني المتقدمة. يمكن استخدام مجموعة EndoFree Plasmid Buffer Set لتحضير 10 ميجا أو 5 جيجا من مستحضرات حمض البلازميد أو الكوزميد النووي عالية الجودة للنقل الجيني.

تم تحديث محلول التخزين المؤقت ER في مجموعات EndoFree Plasmid Kits ليخلو من مادة Triton™ X-114، مما يضمن الامتثال للوائح REACH ومستويات أقل من السموم الداخلية (<0.04 وحدة سمية داخلية/ميكروغرام) بما يتماشى مع معايير إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للقاحات. يقلل محلول التخزين المؤقت المُحسَّن وقت الحضانة من 30 دقيقة على الجليد إلى 5 دقائق فقط في درجة حرارة الغرفة.*

*يرجى الملاحظة: يتضمن هذا التحديث أحجامًا معدلة من محلول التخزين المؤقت ER وأوقات حضانة منقحة في البروتوكول.

أداء

طريقة تحضير البلازميد: السموم الداخلية (EU † / ميكروغرام من الحمض النووي)
مجموعة بلازميد إندو فري: 0.04
مجموعة QIAGEN للبلازميد: 9.3
2x CsCl: 2.6
معلق هلام السيليكا: 1230.0

طريقة تنقية الحمض النووي: نسبة الخلايا المحولة
مجموعة بلازميد إندو فري: 21.0% ± 0.93
مجموعة QIAGEN للبلازميد: 8.1% ± 0.57
معلق هلام السيليكا: 5.2% ± 0.74

تُدمج مجموعات EndoFree Plasmid Kits خطوة فعّالة لإزالة السموم الداخلية ضمن عملية تنقية البلازميد، فلا حاجة إلى عمليات استخلاص إضافية أو أعمدة فصل لإزالة عديدات السكاريد الدهنية. تُصفّى المستخلصات البكتيرية بالترشيح باستخدام خرطوشة QIAfilter Mega-Giga أو Maxi، ويُنقّى الحمض النووي البلازميدي باستخدام رؤوس QIAGEN ذات التدفق الجاذبي التي تحتوي على راتنج التبادل الأيوني. يُمكن الحصول على كميات تصل إلى 500 ميكروغرام (maxi)، و2.5 ملليغرام (mega)، و10 ملليغرام (giga) من الحمض النووي النقي من المزرعة (تعتمد أحجام المزرعة على عدد نسخ البلازميد، وحجم القطعة المُدخلة، وسلالة العائل، ووسط المزرعة). الحمض النووي النقي خالٍ من السموم الداخلية (<0.04 وحدة سمية داخلية/ميكروغرام من الحمض النووي).

بالنسبة لتنقية البلازميدات والكوزميدات منخفضة النسخ، فإن مجموعة EndoFree Plasmid Mega Kit هي خيار أفضل من مجموعة EndoFree Giga Plasmid Kit، وذلك بسبب أحجام المزارع الكبيرة المطلوبة والسعة المحدودة لخرطوشة QIAfilter Mega-Giga.

تزيل مجموعات EndoFree Plasmid السموم الداخلية البكتيرية التي تُطلق أثناء عملية التحلل وتؤثر على نقل الحمض النووي إلى الخلايا الأولية والخلايا المزروعة الحساسة. يتميز الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية المُستخلص من مجموعات EndoFree Plasmid بملاءمته العالية للحصول على نتائج قابلة للتكرار وموثوقة في عملية النقل (انظر الأشكال: طريقة تنقية البلازميد مقابل كفاءة النقل، ونقاء البلازميد مقابل كفاءة النقل، والجداول: مستويات السموم الداخلية في مستحضرات البلازميد، و"يحقق الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية كفاءة عالية في النقل مع الخلايا الأولية"). كما يُعد الحمض النووي فائق النقاء والخالي من السموم الداخلية من QIAGEN مناسبًا لأبحاث العلاج الجيني وغيرها من التطبيقات الحساسة.

مبدأ

الميزات: مجموعة EndoFree Plasmid Maxi
التطبيقات: أبحاث العلاج الجيني، ونقل الجينات إلى الخلايا الحساسة
حجم المزرعة/المادة الأولية: 100-250 مل حجم المزرعة
نوع البلازميد: عالي النسخ، منخفض النسخ، الحمض النووي الكوزميدي
المعالجة: يدوية (تدفق بالجاذبية)
عدد العينات لكل تشغيل: عينة واحدة لكل تشغيل
مدة كل جولة: 125 دقيقة
الناتج: أقل من 500 ميكروغرام

يعتمد مستوى تلوث الحمض النووي البلازميدي المنقى بالسموم الداخلية على طريقة التنقية المستخدمة (انظر الجدول "مستويات السموم الداخلية في مستحضرات البلازميد"). يُظهر الحمض النووي المنقى باستخدام معلق السيليكا مستويات عالية للغاية من السموم الداخلية. تُنتج مجموعات QIAGEN وQIAfilter وHiSpeed ​​Plasmid Kits، بالإضافة إلى الطرد المركزي الفائق باستخدام كلوريد السيزيوم مرتين، حمضًا نوويًا نقيًا جدًا بمستويات منخفضة نسبيًا من السموم الداخلية. تتضمن مجموعات EndoFree Plasmid Kits خطوة مدمجة لإزالة السموم الداخلية، مما ينتج عنه حمض نووي بلازميدي يحتوي على أقل من 0.04 وحدة سمية داخلية/ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي.

خراطيش QIAfilter، المتوفرة في مجموعات QIAfilter وHiSpeed ​​وEndoFree Plasmid، هي وحدات ترشيح خاصة مصممة لاستبدال عملية الطرد المركزي بعد التحلل القلوي للخلايا البكتيرية. تزيل خراطيش QIAfilter رواسب SDS تمامًا وتُنقي مستخلصات البكتيريا في جزء من الوقت اللازم للطرد المركزي، مما يقلل وقت تنقية البلازميد بما يصل إلى ساعة واحدة. تتميز خراطيش QIAfilter Maxi بتصميم يشبه المحقنة، ويتم تنقية المستخلصات في غضون ثوانٍ بدفع السائل عبر المرشح. أما خراطيش QIAfilter Mega-Giga، فتعمل بنظام شفط داخلي لتنقية كميات كبيرة من مستخلصات البكتيريا بكفاءة عالية وبأقل جهد (يرجى ملاحظة أن الزجاجة غير متضمنة في المجموعات).

تم تطوير راتنج التبادل الأيوني الفريد في رؤوس QIAGEN خصيصًا لتنقية الأحماض النووية. وتؤدي خصائصه الاستثنائية في الفصل إلى نقاء الحمض النووي DNA يعادل أو يفوق النقاء الناتج عن جولتين متتاليتين من الطرد المركزي المتدرج باستخدام كلوريد السيزيوم. تعمل رؤوس QIAGEN المعبأة مسبقًا بالجاذبية ولا تجف أبدًا، مما يقلل من الوقت اللازم لتحضير البلازميد. يتجنب نظام تنقية البلازميد QIAGEN بالكامل استخدام المواد السامة مثل الفينول والكلوروفورم وبروميد الإيثيديوم وكلوريد السيزيوم، مما يقلل من المخاطر على المستخدم والبيئة.

السموم الداخلية، المعروفة أيضًا باسم عديدات السكاريد الدهنية أو LPS، هي مكونات غشاء الخلية للبكتيريا سالبة الغرام مثل الإشريكية القولونية (انظر الشكل "جدار الخلية البكتيرية"). تُطلق السموم الداخلية خلال مرحلة تحلل البلازميد أثناء تنقية البلازميد، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة نقل الجينات في سلالات الخلايا الحساسة للسموم الداخلية (انظر الأشكال "طريقة تنقية البلازميد مقابل كفاءة نقل الجينات" و"نقاء البلازميد مقابل كفاءة نقل الجينات"، والجداول "مستويات السموم الداخلية في مستحضرات البلازميد" و"يحقق الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية كفاءة عالية في نقل الجينات مع الخلايا الأولية"). علاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر السموم الداخلية على امتصاص الحمض النووي للبلازميد في تجارب نقل الجينات من خلال التنافس مع الحمض النووي على كاشف نقل الجينات "الحر". كما تحفز السموم الداخلية تنشيطًا غير نوعي للاستجابات المناعية في الخلايا المناعية مثل البلاعم والخلايا البائية، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير نتائج نقل الجينات. تشمل هذه الاستجابات تحفيز تخليق البروتينات والدهون، مثل إنترلوكين-1 والبروستاجلاندين. عمومًا، تُمثل السموم الداخلية متغيرًا خارجًا عن السيطرة في تصميم تجارب النقل الجيني، إذ تؤثر على النتائج وقابليتها للتكرار، مما يجعل مقارنتها وتفسيرها أمرًا صعبًا. في أبحاث العلاج الجيني، قد تتداخل السموم الداخلية عن طريق التسبب في متلازمة الصدمة السمية وتنشيط سلسلة المتممة.

إجراء

تُحلل الخلايا البكتيرية في وسط قلوي، ثم تُنقى المستخلصات الخام باستخدام خرطوشة QIAfilter. في هذه المرحلة، يُضاف محلول إزالة السموم الداخلية إلى المستخلص المُرشح، ويُحضن على الجليد. بعد ذلك، يُحمل المستخلص المُنقى على طرف التبادل الأيوني حيث يرتبط الحمض النووي البلازميدي بشكل انتقائي في ظل ظروف مناسبة من انخفاض الملوحة ودرجة الحموضة. تُزال الحمض النووي الريبي والبروتينات والمستقلبات والشوائب الأخرى ذات الوزن الجزيئي المنخفض عن طريق غسل بمحلول ملحي متوسط، ويُستخلص الحمض النووي البلازميدي فائق النقاء في محلول ملحي عالي التركيز (انظر مخطط "إجراءات مجموعة QIAGEN للبلازميد"). يُركز الحمض النووي ويُزال منه الملح عن طريق الترسيب بالإيزوبروبانول، ثم يُجمع بالطرد المركزي.

التطبيقات

- عملية نقل الجينات، بما في ذلك الخلايا الأولية والحساسة والمعلقة
- أبحاث العلاج الجيني
- إسكات الجينات
- الحقن المجهري

يُعد الحمض النووي المُنقّى باستخدام مجموعات EndoFree Plasmid Kits مناسبًا لأي تطبيق حساس، بما في ذلك: