شركة كياجين، 333842، لوحة منطقة QIAseq 16S/ITS (24)

بادئات مُرتبة، وإنزيمات، ومحاليل منظمة، وخرزات لبناء مكتبات على منصات Illumina؛ تكفي لـ 24 عينة

سمات

- فحص المناطق المتغيرة لجين 16S rRNA البكتيري المحدد ومناطق ITS الفطرية
- تعمل "البادئات المرحلية" على تحسين جودة القاعدة والقراءة
- تقلل الكواشف ذات الحمل الميكروبي المنخفض من التلوث الخلفي
- مدخلات الحمض النووي منخفضة تصل إلى 1 بيكوغرام لتحليل عينات الكتلة الحيوية المنخفضة

تفاصيل المنتج

تُعدّ لوحات QIAseq 16S/ITS الحل الأمثل لتحليل شامل للمجتمعات البكتيرية والفطرية، بدءًا من العينة وصولًا إلى النتائج. صُممت هذه اللوحات خصيصًا لتسلسل مناطق 16S rRNA وITS على منصات Illumina. على عكس الحلول الأخرى، تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS "بادئات مُحددة الطور" لتحسين جودة القراءات وتحديد القواعد، والاستغناء عن إضافة PhiX. إضافةً إلى ذلك، تتميز لوحات QIAseq 16S/ITS باحتوائها على كواشف منخفضة التلوث الحيوي لتقليل التلوث الخلفي، وفحص جميع المناطق المتغيرة من 16S rRNA، كما أنها تسمح باستخدام كميات قليلة من الحمض النووي، مما يُتيح تحليل عينات ذات كتلة حيوية منخفضة.

تتضمن لوحات مناطق QIAseq 16S/ITS، عند دمجها مع أي من مجموعات فهرسة QIAseq 16S/ITS، جميع الكواشف اللازمة لإنتاج مكتبات من الحمض النووي المستخلص. يمكن تهيئة لوحات المناطق لاستهداف منطقة متغيرة واحدة أو اثنتين أو ثلاث من منطقة 16S و/أو منطقة ITS. لتهيئة لوحة مناطق QIAseq 16S/ITS، اختر منتجًا من علامة التبويب "معلومات الطلب" وانقر على "تهيئة".

أداء

جودة عالية للقراءات والقواعد

غالبًا ما ينتج عن تسلسل مكتبات التضخيم المفردة نتائج منخفضة الجودة نظرًا لانخفاض تنوع تركيب القواعد في مناطق البادئات (الشكل A وC: تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS بادئات مُطوَّرة لزيادة تنوع القواعد ودرجات الجودة). وللتغلب على هذه المشكلة، تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS نهج "البادئات المُطوَّرة" (الشكل: بنية البادئات المُطوَّرة المستخدمة في لوحات QIAseq 16S/ITS)، والذي يُضيف من 0 إلى 11 قاعدة إضافية إلى الطرف 5' من بادئ 16S rRNA أو ITS. يؤدي استخدام "البادئات المُطوَّرة" إلى تغيير في توازن النيوكليوتيدات وزيادة تنوع القواعد، مما يؤدي إلى زيادة درجات الجودة (الشكل B وD: تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS بادئات مُطوَّرة لزيادة تنوع القواعد ودرجات الجودة).

الاستخدام الفعال لإنتاجية خلية التدفق

بسبب نهج "البادئ المرحلي"، فإن المكتبات المنتجة باستخدام لوحات QIAseq 16S/ITS معقدة بما يكفي للتخلص من الحاجة إلى PhiX spike-in، مما يتيح الاستخدام الفعال لإنتاجية خلية التدفق.

ضوضاء خلفية منخفضة

يتواجد الحمض النووي البكتيري في كل مكان تقريبًا في حياتنا اليومية، مما يزيد من خطر التلوث أثناء التعامل مع العينات البيولوجية ومعالجتها. علاوة على ذلك، قد يؤدي تصنيع ومعالجة الإنزيمات والكواشف إلى إدخال حمض نووي بكتيري خارجي إلى العينات قيد الدراسة. يقلل هذا التلوث الخلفي من دقة تحديد النمط البكتيري. تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS كواشف ذات حمل حيوي منخفض، والتي تُظهر مستويات منخفضة جدًا من التلوث البكتيري الخارجي في تجارب التحكم السلبي (انظر الشكل). تتميز لوحات QIAseq 16S/ITS بمستويات منخفضة جدًا من التلوث الخلفي نظرًا لاستخدام كواشف ذات حمل حيوي منخفض.

مدخلات منخفضة من الحمض النووي

يمكن استخدام لوحات QIAseq 16S/ITS مع كمية من الحمض النووي البكتيري تتراوح من 1 بيكوغرام إلى 1 نانوغرام، مما يسمح للمستخدمين بتحليل المجتمعات البكتيرية في العينات ذات الكتلة الحيوية المنخفضة (انظر الشكل). يمكن استخدام لوحات QIAseq 16S/ITS مع كمية ضئيلة تصل إلى 1 بيكوغرام من الحمض النووي. أما بالنسبة لتحليل المجتمعات/الأنواع الفطرية، فيمكن للوحات QIAseq 16S/ITS الكشف عن 0.01 نانوغرام من الحمض النووي الفطري في خلفية من 1 نانوغرام من الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية.

تعدد الإرسال

يمكن استخدام كل لوحة لدمج ما يصل إلى 96 عينة في تشغيل Illumina MiSeq باستخدام كيمياء التسلسل V3 بمعدل 2x300. يلزم استخدام مجموعة الفهرسة المناسبة لدمج العدد المطلوب من العينات.

تحليل البيانات

بعد التسلسل، تُحلل البيانات باستخدام برنامج QIAGEN Bioinformatics CLC Genomic Workbench ووحدة Microbial Genomics Pro Suite. يتوفر مسار عمل مُخصص، قابل للتعديل حسب الحاجة، لأتمتة استيراد ملفات FASTQ، وفك تشفير مكتبة العينات، والترشيح والتقليم مع مراقبة الجودة، وتجميع النتائج، والتحليل المعلوماتي الحيوي الثانوي. يُمكّن برنامج QIAGEN Bioinformatics CLC Genomics Workbench مع وحدة Microbial Genomics Pro Suite الباحثين من إعداد تقارير موحدة حول مقاييس جودة مكتبة العينات وجداول وفرة الكائنات الحية، مما يوفر خيارات عديدة للتحليل التفاعلي اللاحق لملامح الميكروبيوم والإبلاغ عن نتائج التجارب. تتضمن وحدة Microbial Genomics Pro Suite أيضًا أدوات لحساب مقاييس التنوع ومقارنة الملامح الميكروبية لعينات مختلفة. يُنتج برنامج CLC Genomics Workbench رسومات بيانية بجودة النشر بتنسيقات سهلة الاستخدام للباحثين لعرض نتائجهم.

​

مبدأ

- تحديد خصائص غالبية أنواع البكتيريا الموجودة في العينة في تحليل واحد
- إجراء دراسات مقارنة لمجتمعات بكتيرية مختلفة
- تحديد خصائص البكتيريا التي لا يمكن استزراعها
- تصنيف الميكروبات بسرعة ودقة أكبر من الطرق التقليدية
- إجراء تحليل متعدد للعينات في نفس عملية التسلسل، مما يوفر حلاً أكثر فعالية من حيث التكلفة
- دراسة الميكروبيومات المعقدة

- ضعف جودة القراءة واستدعاء القواعد نتيجة لانخفاض تعقيد المكتبة
- الاستخدام غير الفعال للإنتاجية المتاحة لكل مكتبة بسبب الحاجة إلى كمية كبيرة من حمض PhiX DNA
- انخفاض دقة التصنيف للعديد من التصنيفات البكتيرية نتيجة التغطية غير الكاملة لجميع المناطق المتغيرة للجين 16S rRNA
- ضوضاء خلفية عالية بسبب الكواشف الملوثة

مقدمة

تُعدّ عملية تسلسل جين الحمض النووي الريبوزي 16S (rRNA) ومنطقة الفاصل المنسوخ الداخلي (ITS) الطريقة الأكثر شيوعًا لتحليل المجتمعات الميكروبية، وذلك للبكتيريا والفطريات على التوالي. ونظرًا لانتشار جيني 16S rRNA وITS على نطاق واسع وطبيعتهما المحفوظة، فإنهما يُعتبران مؤشرين جينيين راسخين يُستخدمان في تحديد وتصنيف البكتيريا والفطريات.

جينات 16S وITS

يتكون جين 16S rRNA من مناطق شديدة الحفظ وأخرى شديدة التغير (انظر الشكل: بنية جين 16S rRNA البكتيري [أعلى] ومنطقة ITS الفطرية [أسفل]). تعمل المناطق المحفوظة كمواقع ارتباط للبادئات لتضخيم المناطق المتغيرة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بينما تحتوي المناطق المتغيرة على تسلسلات يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا وتصنيفها.

تقع منطقة ITS بين الوحدتين الفرعيتين الصغيرتين والكبيرتين للرنا الريبوسومي (rRNA). في حقيقيات النوى، توجد منطقتان ITS: تقع ITS1 بين جيني 18S rRNA و5.8S rRNA، بينما تقع ITS2 بين جيني 5.8S rRNA و28S rRNA (انظر الشكل: بنية جين 16S rRNA البكتيري [أعلى] ومنطقة ITS الفطرية [أسفل]). وقد ثبت أن مناطق ITS تتمتع بأعلى احتمالية لتحديد هوية مجموعة واسعة من الفطريات بنجاح.

فوائد تقنية التسلسل الجيني من الجيل الجديد (NGS) لتسلسل جين 16S rRNA ومنطقة ITS

توفر تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) طريقةً لتحليل المجتمعات الميكروبية داخل العينات البيولوجية دون الحاجة إلى زراعة ميكروبية. ومع ازدياد إنتاجية أنظمة NGS الحديثة، أصبح من الشائع دمج مكتبات من عينات بيولوجية متعددة في عملية تسلسل واحدة، مما مكّن باحثي علم الأحياء الدقيقة من تحليل مئات المجتمعات الميكروبية بالتوازي وبتكلفة منخفضة. ويُعد تحديد تسلسل جينات العلامات العالمية، مثل جين 16S rRNA وجين ITS، باستخدام تقنية NGS طريقةً فعّالة لدراسة المجتمعات الميكروبية، حيث يمكن استخدامها في:

التحديات الحالية المتعلقة بتسلسل الحمض النووي الريبوزي 16S و ITS

تشمل الصعوبات التي تواجه تقنية التسلسل الجيني من الجيل التالي (NGS) لجينات الحمض النووي الريبوزي 16S ومناطق ITS ما يلي:

التحكم الذكي

يُعدّ QIAseq 16S/ITS Smart Control حمضًا نوويًا اصطناعيًا يُستخدم كعنصر تحكم إيجابي في خطوات بناء المكتبة، لاحتوائه على مواقع ارتباط البادئات من بكتيريا الإشريكية القولونية. يتم استبدال منطقة الحمض النووي الريبوزي 16S شديدة التغير، الواقعة بين تسلسلات ارتباط البادئات، بتسلسلات اصطناعية مُستخلصة من نبات الرشاد (انظر الشكل: بنية الحمض النووي QIAseq 16S/ITS Smart Control). لا يُمكن تصنيف هذه التسلسلات الاصطناعية على أنها بكتيرية أو فطرية، لذا فإن أي تسلسلات يتم تصنيفها تُعزى إلى التلوث البيئي الذي حدث أثناء بناء المكتبة.

إجراء

تستخدم لوحات QIAseq 16S/ITS تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على مرحلتين. تبدأ المرحلة الأولى بتحليل الحمض النووي المستخلص من المجتمعات البكتيرية، حيث يتم إثراء منطقتي 16S rRNA المتغيرة وITS باستخدام البادئات المُحددة الطور. بعد عملية تنقية باستخدام الخرز، تُضاف محولات المكتبة إلى نهايات نواتج التضخيم في المرحلة الثانية. تُنتج عملية تنقية ثانية باستخدام الخرز مكتبات قابلة للقياس الكمي والتسلسل (انظر الشكل: آلية عمل لوحات QIAseq 16S/ITS). يُوصى باستخدام تقنية V3 2x300 للتسلسل.

التطبيقات

الكشف الدقيق عن أنواع البكتيريا

يعتمد تركيب المجتمع البكتيري، استنادًا إلى جين 16S rRNA، على المنطقة المتغيرة التي يتم تحليلها. على سبيل المثال، لا يمكن تحديد بكتيريا Streptococcus mutans من خلال تسلسل المناطق المتغيرة V1V2 وV2V3 وV3V4 وV4V5. ومع ذلك، فإن التحليل الشامل لجميع المناطق المتغيرة باستخدام لوحة QIAseq 16S/ITS Screening Panel يُمكّن من الكشف عن هذه البكتيريا (انظر الشكل: يوفر فحص مجموعة من المناطق المتغيرة تحليلًا بكتيريًا أكثر دقة مقارنةً بفحص مناطق متغيرة فردية فقط).