شركة كياجين، 762164، مجموعة PAXgene لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم (IVD) (50)

٥٠ عمودًا دوارًا من PAXgene، و٥٠ عمودًا دوارًا من PAXgene Shredder، وأنابيب معالجة، وإنزيم DNase I خالي من RNase، وكواشف ومحاليل منظمة خالية من RNase. تُستخدم مع أنابيب PAXgene Blood RNA

سمات

- للتشخيص المختبري، باستخدام أنابيب PAXgene Blood RNA
- نظام متكامل للتجميع والتثبيت والتنقية
- تثبيت الحمض النووي الريبي لمدة تصل إلى 3 أيام عند درجة حرارة 18-25 درجة مئوية
- استقرار لمدة 60 شهرًا على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية
- معالجة العينات بشكل موحد قبل التحليل
- يمكن أتمتة عملية التنقية على جهاز QIAcube Connect MDx*

تفاصيل المنتج

يتألف نظام PAXgene Blood RNA من أنابيب PAXgene Blood RNA (متوفرة من BD، رقم المنتج 762165) لجمع الدم وتثبيته ونقله، ومجموعة PAXgene Blood RNA لعزل وتنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام غشاء السيليكا في عمود طرد مركزي. يمكن إجراء التنقية يدويًا باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق، أو آليًا باستخدام جهاز QIAcube Connect MDx. حصل النظام على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للتسويق، ويوفر مواصفات أداء دقيقة للاستخدام في التشخيص المختبري.

أداء

نظام الاختبار: فحص FOS/18S rRNA
مقارنة البيانات: المتوسط
(ΔΔC T ): (ΔΔC T )
إمكانية التكرار داخل كل مستخدم وبين جميع الدفعات
جميع المستخدمين، المجموعة 1 – المجموعة 1: 0.00
جميع المستخدمين، المجموعة 1 – المجموعة 2: –0.03
جميع المستخدمين، المجموعة 1 - المجموعة 3: -0.21
إمكانية التكرار داخل كل دفعة وبين جميع المستخدمين
جميع القطع، المستخدم أ – المستخدم أ: 0.00
جميع القطع، المستخدم أ - المستخدم ب: -0.46
جميع القطع، المستخدم أ – المستخدم ج: –0.31

صُممت أنابيب PAXgene Blood RNA لجمع عينات الدم الكامل وتثبيت الحمض النووي الريبوزي (RNA) داخل الخلايا لمدة تصل إلى 3 أيام عند درجة حرارة 18-25 درجة مئوية (انظر الشكلين "ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 18-25 درجة مئوية: FOS" و"ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 18-25 درجة مئوية: IL1B") أو لمدة تصل إلى 5 أيام عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية (انظر الشكلين "ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 2-8 درجة مئوية: FOS" و"ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 2-8 درجة مئوية: IL1B"). وتشير البيانات المتاحة حاليًا إلى إمكانية تثبيت الحمض النووي الريبوزي الخلوي لمدة 60 شهرًا على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية.

يتميز الحمض النووي الريبوزي الكلي المستخلص باستخدام نظام PAXgene Blood RNA System بنقائه العالي، حيث تتراوح قيم الامتصاص عند 260 نانومتر/280 نانومتر بين 1.8 و2.2، ويحتوي على ≤1.0% من الحمض النووي الجينومي (وزن/وزن). ولا تُظهر 95% على الأقل من العينات أي تثبيط في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) عند استخدام ما يصل إلى 30% من المستخلص.

يبلغ متوسط ​​وقت تحضير العينة (استنادًا إلى بيانات من 12 عينة مُحضّرة) حوالي 90 دقيقة، منها 40 دقيقة فقط من العمل اليدوي. تكون كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلصة من 2.5 مل من دم بشري كامل سليم ≥ 3 ميكروغرام في ≥ 95% من العينات المُعالجة. ونظرًا لاعتماد كمية الحمض النووي الريبوزي المستخلص بشكل كبير على المتبرع، فقد تختلف الكمية المُستخلصة من متبرع لآخر. بالنسبة للمتبرعين الأفراد، يوفر نظام PAXgene لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم كميات عالية الدقة وقابلة للتكرار (انظر الشكلين "تنقية الحمض النووي الريبوزي القابلة للتكرار" و"قابلية تكرار كمية الحمض النووي الريبوزي المستخلص")، بالإضافة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) القابل للتكرار (انظر الشكلين "قابلية التكرار بين المستخدمين" و"قابلية التكرار بين دفعات المجموعة" والجدول)، مما يجعله نظامًا عالي الكفاءة لاختبارات التشخيص السريري.

بلغت كمية الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستخلصة من 2.5 مل من الدم الكامل البشري السليم 3 ميكروغرام أو أكثر في 95% على الأقل من العينات المعالجة. يوضح الشكل "كمية ونقاء الحمض النووي الريبوزي - المعالجة الآلية" كمية الحمض النووي الريبوزي المستخلصة من 288 عينة تم تحضيرها باستخدام البروتوكول الآلي مع 3 دفعات من المجموعة بواسطة 3 فنيين. ولأن هذه الدراسات استخدمت عينات دم مجمعة بدلاً من أنابيب PAXgene Blood RNA الفردية، فإن النتائج لا تعكس كمية الحمض النووي الريبوزي المتوقعة من عينات الدم الفردية. ونظرًا لأن الكمية تعتمد بشكل كبير على المتبرع، فقد تختلف الكميات المستخلصة من الأفراد.

لا تُظهر 95% على الأقل من العينات أي تثبيط في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) عند استخدام ما يصل إلى 30% من المستخلص. وباستخدام البروتوكول الآلي، يصبح التلوث المتبادل بين العينات غير قابل للكشف، وذلك وفقًا لقياسات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي في الوقت الحقيقي لتسلسلات بيتاغلوبين ونسخ FOS في عينات سالبة الحمض النووي الريبي (ماء) مقترنة بعينات موجبة الحمض النووي الريبي (دم بشري كامل) في نفس الدورة.

يتميز الحمض النووي الريبوزي (RNA) المُستخلص باستخدام نظام PAXgene Blood RNA System والبروتوكول الآلي بنقائه العالي، كما يتضح من عدم وجود تثبيط لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) (انظر أعلاه) وقيم A260/A280 التي تتراوح بين 1.8 و2.2. يوجد الحمض النووي الجينومي بنسبة ≤1% (وزن/وزن) في ≥95% من جميع العينات، وذلك وفقًا لقياسات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي لتسلسل جين بيتا-أكتين. يوضح الشكل "إنتاجية ونقاء الحمض النووي الريبوزي - المعالجة الآلية" قيم A260/A280 والحمض النووي الجينومي النسبي لـ 288 عينة تم تحضيرها باستخدام البروتوكول الآلي بثلاث دفعات من المجموعة بواسطة ثلاثة فنيين.

يوفر البروتوكول الآلي لتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام نظام PAXgene Blood RNA نتائج RT-PCR قابلة للتكرار بدرجة عالية، كما هو موضح في الشكل "قابلية التكرار بين البروتوكولات الآلية واليدوية"، مما يجعله قويًا للغاية لاختبارات التشخيص السريري.

المستخدم: الفني الذي أجرى الدراسة. رقم الدفعة: رقم دفعة المجموعة المستخدمة في هذه الدراسة. الانحراف المعياري: SD. تُعرض قيم متوسط ​​ΔΔCT (عدد العينات = 120) والانحرافات المعيارية للبيانات الواردة في الشكلين "قابلية التكرار بين المستخدمين" و"قابلية التكرار بين دفعات المجموعة".

مبدأ

تُستخدم مجموعة PAXgene لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم لتنقية الحمض النووي الريبوزي الكلي من 2.5 مل من الدم البشري الكامل المجمع في أنبوب PAXgene لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم. الإجراء بسيط ويمكن تنفيذه يدويًا أو آليًا (انظر المخططات الانسيابية "إجراء PAXgene اليدوي لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم" و"إجراء PAXgene الآلي لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي من الدم").

تحتوي أنابيب PAXgene Blood RNA على تركيبة كاشف خاصة تعتمد على تقنية تثبيت الحمض النووي الريبوزي (RNA) الحاصلة على براءة اختراع (براءات الاختراع الأمريكية 6,602,718 و6,617,170). تحمي هذه التركيبة جزيئات الحمض النووي الريبوزي من التحلل بواسطة إنزيمات RNase، وتقلل من التغيرات في التعبير الجيني خارج الجسم الحي. تُستخدم أنابيب PAXgene Blood RNA لجمع الدم الكامل وتثبيت الحمض النووي الريبوزي داخل الخلايا لمدة تصل إلى 3 أيام عند درجة حرارة 18-25 درجة مئوية (انظر الشكلين "ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 18-25 درجة مئوية: FOS" و"ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 18-25 درجة مئوية: IL1B") أو لمدة تصل إلى 5 أيام عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية (انظر الشكلين "ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 2-8 درجة مئوية: FOS" و"ثبات الحمض النووي الريبوزي عند 2-8 درجة مئوية: IL1B"). تُظهر البيانات المتاحة حاليًا استقرار الحمض النووي الريبي الخلوي لمدة 60 شهرًا على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية.

إجراء

إجراء PAXgene Blood RNA بسيط ويمكن إجراؤه باستخدام الإجراءات اليدوية أو الآلية (انظر المخططات الانسيابية "إجراء PAXgene Blood RNA اليدوي" و "إجراء PAXgene Blood RNA الآلي").

إجراء تنقية الحمض النووي الريبوزي من الدم باستخدام PAXgene يدويًا: تبدأ عملية التنقية بخطوة طرد مركزي لترسيب الأحماض النووية في أنبوب PAXgene Blood RNA. يُغسل الراسب ويُعاد تعليقه، ثم يُحضن في محاليل منظمة مُحسّنة مع بروتينيز K لهضم البروتينات. يُجرى طرد مركزي إضافي عبر عمود PAXgene Shredder الدوار لتجانس مستخلص الخلية وإزالة بقايا الخلايا المتبقية، ويُنقل السائل الطافي من الجزء المتدفق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. يُضاف الإيثانول لضبط ظروف الارتباط، ويُطبق المستخلص على عمود PAXgene RNA الدوار. خلال عملية طرد مركزي قصيرة، يرتبط الحمض النووي الريبوزي بشكل انتقائي بغشاء السيليكا الخاص بـ PAXgene أثناء مرور الملوثات. تُزال الملوثات المتبقية في عدة خطوات غسل فعالة. بين خطوتي الغسل الأولى والثانية، يُعالج الغشاء بإنزيم DNase I لإزالة آثار الحمض النووي المرتبط. بعد خطوات الغسل، يتم استخلاص الحمض النووي الريبي في محلول الاستخلاص وتسخينه لتفكيكه.

إجراء PAXgene Blood RNA الآلي: تحضير العينة، المؤتمت على جهاز QIAcube Connect MDx، يتبع نفس خطوات الإجراء اليدوي، مما يتيح لك الاستمرار في استخدام مجموعة PAXgene Blood RNA لتنقية الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

يتكون بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي الآلي من جزأين (أو بروتوكولين)، "PAXgene Blood RNA Part A" و "PAXgene Blood RNA Part B"، مع تدخل يدوي قصير بين الجزأين.

تُنقل كريات الحمض النووي، بعد الطرد المركزي والغسل وإعادة التعليق، من أنبوب PAXgene Blood RNA إلى أنابيب المعالجة، التي توضع بدورها في وحدة التحريك الحراري على طاولة عمل QIAcube Connect MDx. يختار المشغل بروتوكول "PAXgene Blood RNA Part A" ويبدأ تشغيله من القائمة. يُنفذ جهاز QIAcube Connect MDx خطوات البروتوكول حتى استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) في محلول الاستخلاص. ينقل المشغل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة، التي تحتوي على الحمض النووي الريبوزي (RNA) المنقى، إلى وحدة التحريك الحراري لجهاز QIAcube Connect MDx. يختار المشغل بروتوكول "PAXgene Blood RNA Part B" ويبدأ تشغيله من القائمة، ثم يقوم جهاز QIAcube بعملية التمسخ الحراري.

يبلغ متوسط ​​وقت تحضير العينة (استنادًا إلى بيانات من 12 عملية تحضير عينة) 151 دقيقة، مع حوالي 20 دقيقة فقط من وقت العمل اليدوي.

التطبيقات

عند استخدام المجموعة بالتزامن مع أنابيب PAXgene Blood RNA، يوفر النظام الحمض النووي الريبي داخل الخلايا من الدم الكامل لـ RT-PCR المستخدم في الاختبارات التشخيصية الجزيئية.