كياجين، EN32-050، سالتوناز (5000 وحدة)

٢٠ ميكرولتر × ٢٥٠ وحدة/ميكرولتر. درجة حرارة التخزين: -٢٠ درجة مئوية بدون دورة إذابة؛ -٨٠ درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. يبقى المنتج مستقرًا عند -٢٠ درجة مئوية لمدة ٢٤ شهرًا على الأقل. لا يُلاحظ أي انخفاض في النشاط حتى ٦ أسابيع من الحضانة عند ٣٧ درجة مئوية.

سمات

- درجة البيولوجيا الجزيئية (MBG) ودرجة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP)
- نشط للغاية في نطاق واسع من درجات الحرارة (>20% عند 15-55 درجة مئوية)
- أقصى نشاط نيوكليازي عند تركيزات عالية من الملح (التركيز الأمثل لكلوريد الصوديوم أو كلوريد البوتاسيوم هو 450-600 ملي مولار) ومضافات أخرى للمحلول المنظم
- نشط للغاية في المحاليل المنظمة النموذجية ووسائط النمو
- يتطلب ≥1 ملي مول من Mg 2+ للتنشيط ويظهر طيفًا واسعًا من نشاط الرقم الهيدروجيني (الأمثل عند الرقم الهيدروجيني 8.5، نطاق الرقم الهيدروجيني للعمل > مع نشاط إنزيمي ≥20% 6.8–9.3).

تفاصيل المنتج

إنزيم سالتوناز هو إنزيم نووي داخلي مُعاد التركيب، مُستخلص من بكتيريا مُحبة للبرودة، ويُنتج في بكتيريا الإشريكية القولونية. يتميز بنشاطه العالي في نطاق واسع من تركيزات الأملاح ومستويات الحموضة، مما يجعله فعالاً في هضم كلٍ من الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA في ظل ظروف مُنظمة ودرجات حرارة مُختلفة. يُظهر سالتوناز نشاطًا قويًا في البيئات الصعبة، بما في ذلك البيئات ذات المحتوى الملحي العالي ونطاق الحموضة الواسع. هذه الخصائص تجعل من سالتوناز أداةً لا غنى عنها للتخلص من تلوث الأحماض النووية غير المرغوب فيه أثناء عمليات تنقية البروتينات في كلٍ من المختبرات وعمليات التصنيع الحيوي.

يتم تزويده بـ 20 ملي مول من Tris (pH 7.1 w 25°C)، و 620 ملي مول من NaCl، و 26 ملي مول من MgCl 2 و 50٪ (حجم/حجم) من الجلسرين.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها زيادة في الامتصاص عند 260 نانومتر بمقدار 1.0 في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول منظم Tris-HCl بتركيز 50 ملي مولار، ودرجة حموضة 8.5 (25 درجة مئوية) مضاف إليه 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و5 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم، و0.1 مليغرام/مل من ألبومين المصل البقري، و0.5 مليغرام/مل من الحمض النووي لحيوانات الرنجة المنوية كركيزة.

أداء

سالتوناز: درجة البيولوجيا الجزيئية
النشاط: ≥250 وحدة/ميكرولتر
النقاء: ≥95%
نقاء البروتين: SDS-PAGE
نشاط البروتياز: لم يتم الكشف عن أي نشاط.
السموم الداخلية: لم يتم اختبارها
الحمل الميكروبي: لم يتم اختباره

بنية الكروماتين: اللزوجة
يلتف الحمض النووي حول الهستونات. الهستونات موجبة الشحنة والحمض النووي سالب الشحنة: تركيز 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم يقلل اللزوجة ويزيد من إنتاجية الناقل الفيروسي عن طريق إزالة الحمض النووي المضيف والكروماتين

- يلتف الحمض النووي حول الهستونات
- الهستونات ذات الشحنة الموجبة والحمض النووي ذو الشحنة السالبة

- يقلل تركيز 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم من اللزوجة ويزيد من إنتاجية الناقل الفيروسي عن طريق إزالة الحمض النووي للمضيف والكروماتين

- يؤدي التكتل إلى تعقيد عملية الإنتاج والتنقية
- تقلل التركيزات العالية من الأملاح في محلول التحلل من تكتل الناقل

- يتم استخدام نطاق واسع من تركيزات الإندونوكلياز
- يتراوح بين 1 إلى 1000 وحدة/مل؛ استثمار باهظ الثمن للغاية

*إخلاء مسؤولية لمصنعي الأدوية

"مصنّع وفقًا لمعايير التصنيع الجيد" هو مصطلح تسويقي تستخدمه شركة QIAGEN للإنزيمات المصنّعة وفقًا لمعايير الجودة المعتمدة، بما في ذلك ISO 13485 وUS QSR (21 CFR 820) وISO 9001. هذه الإنزيمات مناسبة للاستخدام في الصناعات الدوائية الحيوية، وتلبي متطلبات نقاء صارمة، وخالية من المواد ذات الأصل الحيواني المستخدمة في عمليات التصنيع والمنتج النهائي. يتم إنتاجها في مسار مخصص وباستخدام معدات متوافقة مع معايير المواد ذات الأصل الحيواني. لا تحتوي إنزيمات "التصنيع وفقًا لمعايير التصنيع الجيد" على مضادات حيوية من نوع بيتا لاكتام، وتتميز بانخفاض مستويات السموم الداخلية والحمل الميكروبي. عند دمجها في عمليات تصنيع الأدوية، تُعتبر "مكونات غير فعالة" ولا يُقصد بها البقاء في المنتج الدوائي النهائي. تقع على عاتق العميل مسؤولية ضمان سلامة المنتج النهائي المستخدم ومطابقته للمعايير، بما في ذلك الالتزام بجميع المتطلبات القانونية والتنظيمية ذات الصلة، بالإضافة إلى التحقق من أن الإنزيمات تعمل وتؤدي وظيفتها وفقًا للمواصفات.

على الرغم من التزام شركة QIAGEN بأنظمة إدارة الجودة الصارمة بصفتها شركة مصنعة للأجهزة الطبية، إلا أنها لا تنتج المكونات الصيدلانية الفعالة أو السواغات، كما أنها لا تلتزم بلوائح ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) للأدوية. تقع على عاتق الشركة المصنعة للأدوية مسؤولية تقييم مدى ملاءمة إنزيمات QIAGEN "المطابقة لمعايير GMP" ضمن عمليات الإنتاج الخاصة بها، وضمان الامتثال لجميع المتطلبات القانونية والتنظيمية المعمول بها. لا تقدم QIAGEN أي إقرارات أو ضمانات إلا ما هو منصوص عليه صراحةً في شروط وأحكام البيع الخاصة بها.

مبدأ

التحديات في التصنيع الحيوي: الحاجة إلى إزالة فعالة للحمض النووي للخلايا المضيفة

تواجه صناعة الأدوية الحيوية، وخاصةً إنتاج النواقل الفيروسية، تحدياتٍ بالغة الأهمية لتحقيق نقاءٍ عالٍ والامتثال للمتطلبات التنظيمية. ومن أبرز هذه التحديات إزالة الحمض النووي للخلايا المضيفة، الذي قد يُسبب مخاطر مثل السرطان والعدوى إذا بقي في المنتج النهائي. يُشكل تركيب الكروماتين، حيث يرتبط الحمض النووي بإحكام حول الهستونات، عوائق كبيرة أمام وصول الإنزيمات الداخلية إلى الحمض النووي وتحليله بكفاءة. إضافةً إلى ذلك، قد تؤدي التركيزات العالية للحمض النووي إلى زيادة لزوجة المحلول، مما يُعيق نشاط الإنزيم، ويُقلل من كفاءة العملية، ويُعقد خطوات التنقية اللاحقة. تتطلب هذه التحديات حلولاً متخصصة للغاية لا تقتصر على الأداء المتسق في ظل ظروف متنوعة فحسب، بل تحافظ أيضاً على نشاطها العالي لتلبية الطلب المتزايد باستمرار في صناعة الأدوية الحيوية.

دور الملح في تحلل الخلايا وتقليل اللزوجة

يُعدّ الملح عنصرًا أساسيًا في تحسين عملية تحلل الخلايا وتعزيز إنتاج النواقل الفيروسية. فبينما تعتمد العديد من العمليات الحيوية على تركيزات الملح الفسيولوجية، غالبًا ما تستفيد عملية تنقية النواقل الفيروسية من استخدام تركيزات عالية من الملح خلال مرحلة تحلل الخلايا. يُساعد الملح على تقليل تكتل الجسيمات الفيروسية، مما يضمن زيادة إنتاجية المنتج. كما يُساعد في تقليل اللزوجة الناتجة عن الحمض النووي المُحرر، مما يسمح للإنزيمات الداخلية بالعمل بكفاءة أكبر. ومن خلال تقليل اللزوجة، تُتيح تركيزات الملح العالية معالجةً أكثر سلاسةً في المراحل اللاحقة، وتُحسّن كفاءة سير العمل بشكل عام. صُمم إنزيم سالتوناز، وهو إنزيم داخلي نشط في وجود الملح، خصيصًا ليعمل على النحو الأمثل في ظل ظروف الملح العالية، مما يُسهّل عملية قطع الحمض النووي بكفاءة إلى أجزاء يتراوح طولها بين 3 و5 نيوكليوتيدات، مما يجعله حلاً آمنًا في إنتاج النواقل الفيروسية.

إجراء

- مستوى تلوث الأحماض النووية
- درجة حرارة الحضانة
- مدة الحضانة
- تركيز الملح
- ومركبات أخرى موجودة في خليط التفاعل.

- NaCl: 500 ملي مولار (ملاحظة: يتطلب إنزيم سالتوناز حدًا أدنى من 150 ملي مولار من NaCl لتعزيز نشاطه)
- MgCl 2 : 5 mM (ملاحظة: يلزم وجود 2 mM على الأقل من أيونات Mg²⁺ لتنشيط إنزيم سالتوناز)
- درجة الحموضة: 8.5 (أو أقل، مثل 7.4)
- درجة الحرارة: 37 درجة مئوية (أو أقل، مثل 23 درجة مئوية)

ضبط الجودة

يُقاس نشاط الإنزيم في حجم تفاعل 1.575 مل يحتوي على حمض نووي منوي لسمك الرنجة كركيزة، ويُحضن لمدة 30 دقيقة عند درجة حموضة 8.5 ودرجة حرارة 37 درجة مئوية مع إنزيم يُحلل الحمض النووي إلى قليل النوكليوتيدات القابلة للذوبان في الأحماض. وحدة واحدة من الإنزيم تُسبب زيادة في الامتصاص عند الطول الموجي 260 بمقدار 1.0.

تبلغ نقاوة سالتوناز MBG ≥ 95%، وفقًا لتقييمها بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. أما نقاوة سالتوناز من الدرجة GMP فتبلغ ≥ 99%، وفقًا لتقييمها بواسطة HPLC والرحلان الكهربائي SDS-PAGE.

يُقاس نشاط البروتياز بحضانة 10 ميكروغرام من بروتين مصل الألبومين البقري مع 10 ميكروغرام من الإنزيم لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية. تُعرض النتائج على هلام بولي أكريلاميد. لم يُلاحظ أي تحلل لمزيج البروتين، وذلك وفقًا لتحليل SDS-PAGE مع الكشف باستخدام صبغة كوميسي الزرقاء.

يتم قياس الحمل الحيوي وفقًا لـ Ph Eur 2.6.12. الفحص الميكروبيولوجي للمنتجات غير المعقمة (العدد الإجمالي للبكتيريا الهوائية الحية).

السموم الداخلية - تفاعل LAL آلي باستخدام نظام CHARLES RIVER Endosafe®nexgen-PTS™. يُستخدم اختبار السموم الداخلية البكتيرية للكشف عن السموم الداخلية أو تحديد كميتها في البكتيريا سالبة الغرام باستخدام مستخلص الخلايا الأميبية من سرطان حدوة الحصان (Limulus polyphemus أو Tachypleus tridentatus). تعتمد التقنية اللونية على ظهور اللون بعد انقسام معقد الببتيد-الكروموجين الاصطناعي.

الاستخدام

يعتمد التركيز النهائي الأمثل لإنزيم سالتوناز في التفاعل على عدة عوامل:

نوصي بضبط تركيز الإنزيم عند 20-50 وحدة/مل، مع اعتبار الشروط التالية مثالية:

التطبيقات

- إنتاج النواقل الفيروسية للعلاج الجيني (مثل الفيروسات الغدية، والفيروسات المرتبطة بالغدية، والفيروسات البطيئة، والفيروسات المحللة للأورام)
- إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروسات (VLPs)
- تنقية البروتينات والإنزيمات المؤتلفة
- تقليل اللزوجة ومنع تجمعات الحمض النووي أثناء خطوة تحلل الخلايا
- إزالة التلوث غير المرغوب فيه بالأحماض النووية في كواشف البيولوجيا الجزيئية في الأنظمة الصعبة

يُستخدم هذا في تطبيقات مثل: