كياجين، G5010L، يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز (10000 وحدة)

Uracil DNA Glycosylase (5.0 مل عند 2000 وحدة / مل) و 10x UDG Reaction Buffer (3 × 1.5 مل).

سمات

- يزيل اليوراسيل من الحمض النووي
- لا يُظهر أي نشاط قابل للقياس على النيوكليوتيدات القصيرة (<6 قواعد) وركائز الحمض النووي الريبي (RNA).

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم يوراسيل-دي إن إيه جليكوزيلاز عملية تحلل الرابطة N-جليكوزيلية بين اليوراسيل والسكر، تاركًا موقعًا خاليًا من القاعدة في الحمض النووي أحادي أو مزدوج السلسلة المحتوي على اليوراسيل. ولا يُظهر هذا الإنزيم أي نشاط قابل للقياس على قليل النوكليوتيدات القصيرة (أقل من 6 قواعد)، أو على ركائز الحمض النووي الريبي.

يتم توفير هذا الإنزيم في 10 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من NaCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول التفاعل UDG 10x على 200 ملي مولار من Tris-HCl، و10 ملي مولار من DTT، و10 ملي مولار من EDTA؛ درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 100 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 100 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 25693 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة E. coli معاد تركيبها تحمل جين Uracil DNA Glycosylase من E. coli K-12.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تحفز إطلاق 1.8 نانومول من اليوراسيل في 30 دقيقة من الحمض النووي المزدوج السلسلة، والموسوم بالتريتيوم، والذي يحتوي على اليوراسيل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في محلول تفاعل UDG 1x.

إجراء

تعليمات الاستخدام

١. استخدم محلول التفاعل UDG المرفق بتركيز ١x. هذا الإنزيم نشط في معظم محاليل تفاعلات البيولوجيا الجزيئية، لذا لا داعي لتغيير المحاليل. ٢. أضف ٠.٥ ميكرولتر من UDG إلى تفاعل يحتوي على ركيزة DNA تحتوي على اليوراسيل (حتى ٠.١ ميكروغرام) في حجم تفاعل إجمالي قدره ٢٠ ميكرولتر. ٣. حضّن المزيج عند درجة حرارة ٣٧-٥٠ درجة مئوية لمدة ٣٠ دقيقة.

ملاحظة: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق يُعطّل الإنزيم جزئيًا فقط. في حال الحاجة إلى تعطيله بالكامل، يُنصح بإضافة مُثبِّط لإنزيم يوراسيل جليكوزيلاز أو تنقية التفاعل باستخدام الطرق المناسبة. يُوصى باستخدام إنزيم UNG غير المستقر حراريًا (G5030L) إذا كان من المرغوب فيه تعطيل إنزيم UDG بسرعة وبشكل كامل عند درجات حرارة منخفضة.

ملاحظة: يمكن تعديل البروتوكول لاستخدامه في تطبيقات محددة.

ضبط الجودة

تم قياس النشاط النوعي باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل بتركيز 1x، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) الموسوم بـ 3H-dUTP ومحلول تفاعل UDG بتركيز 1x. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- منع انتقال العدوى في تفاعل البوليميراز المتسلسل
- إنشاء مواقع خالية من القواعد تحتوي على حمض نووي أحادي أو مزدوج السلسلة

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: