كياجين، G5020L، UDG غير مستقر حرارياً (500 وحدة)

500 وحدة من UDG الحراري (0.5 مل عند 1000 وحدة/مل) و10x محلول تفاعل UDG الحراري (2 × 1.5 مل).

سمات

- يزيل اليوراسيل من الحمض النووي، تاركًا موقع AP
- يتم تعطيله عن طريق حضانة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أعلى من 50 درجة مئوية
- لا يوجد نشاط على ركائز الحمض النووي الريبي

تفاصيل المنتج

يزيل إنزيم UDG غير المستقر حراريًا اليوراسيل من الحمض النووي DNA عن طريق تحلل الرابطة N-جليكوسيلية بين الديوكسي ريبوز والقاعدة، تاركًا موقعًا خاليًا من البيورين أو البيريميدين. لا يُظهر هذا الإنزيم أي نشاط على ركائز الحمض النووي RNA، مما يجعله مناسبًا لتفاعل RT-PCR. يتم تعطيل هذا الإنزيم (1-10 وحدات) تمامًا بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية في محلول التفاعل 1x، كما تم قياسه في اختبار توصيف الوحدة.

يتم توفير هذا الإنزيم في 50 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من NaCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول التفاعل 10x على 700 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من NaCl، و10 ملي مولار من EDTA، و1 مليغرام/مل من BSA؛ درجة الحموضة 8 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 10 وحدات
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 10 وحدات
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 5 وحدات
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 5 وحدات

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 26218 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين جليكوزيلاز اليوراسيل DNA المؤتلف غير المستقر حرارياً والذي تم عزله من بكتيريا بحرية.

الوحدة الواحدة هي كمية UDG غير المستقرة حرارياً المطلوبة لإطلاق 1 نانومول من اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على dU في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

ملحوظات:

يمكن الاستفادة من إضافة إنزيم يوراسيل-دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG) إلى سير العمل الخاص بإجراء التحليلات المتكررة ذات الحجم الكبير لاستبعاد التلوث العابر.

تُجرى تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام dUTP في مزيج النيوكليوتيدات، ويُحضن المزيج مع إنزيم UDG قبل بدء عملية التضخيم. يعمل إنزيم UDG على إزالة اليوراسيل من ناتج تفاعل PCR، بحيث يتم هضم النواتج المتبقية في كل تفاعل جديد ومنعها من التضخيم، بينما تبقى قوالب الحمض النووي الأصلية سليمة. هذا يمنع التلوث الناتج عن تفاعلات PCR وqPCR وRT-PCR، والذي يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

في السابق، كانت درجات حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) محدودة بدرجات حرارة التفاعل المثلى لإنزيمات النسخ العكسي من الأجيال السابقة. يؤدي ضبط درجة حرارة تخليق الحمض النووي التكميلي عند 50 درجة مئوية إلى تأخير قيم العتبة الكمية (C q) لأن الحمض النووي المُضخّم حديثًا والذي يحتوي على dUTP يُقطع بواسطة إنزيم UDG. يجب على المستخدمين الاختيار بين منع التلوث العابر، وتأخير قيمة العتبة الكمية، والمخاطرة بحدوث التلوث العابر، والحفاظ على قيم العتبة الكمية.

يؤدي استخدام خطوة تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) عند درجة حرارة مرتفعة تبلغ 55 درجة مئوية إلى الحفاظ على قيم C q. يتميز إنزيم StableScript بدرجة حرارة تفاعل مثالية تتراوح بين 50 و65 درجة مئوية، ويتوافق جيدًا مع إنزيم UDG غير المستقر حراريًا (G5020L).

إجراء

- استخدم محلول التفاعل UDG المرفق بتركيز 1x. هذا الإنزيم نشط في معظم محاليل التفاعل في البيولوجيا الجزيئية، لذلك لا داعي لتغيير المحاليل.
- أضف 0.5 ميكرولتر من UDG (G5020L) إلى تفاعل مع ركيزة الحمض النووي المحتوية على اليوراسيل (حتى 0.1 ميكروغرام) في تفاعل إجمالي حجمه 20 ميكرولتر.
- حضّن عند درجة حرارة 25-37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- يمكن تعطيل هذا الإنزيم تمامًا عن طريق حضانة لمدة 10 دقائق في درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية.

تعليمات الاستخدام

ملاحظة: يمكن تعديل البروتوكول لاستخدامه في تطبيقات محددة.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1x (70 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار EDTA، 100 ميكروغرام/مل BSA: pH 8.0 عند 25 درجة مئوية) وأضيفت إلى التفاعلات التي تحتوي على ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بطول 1.1 كيلوبايت موسوم بـ 3H-dUTP في محلول تفاعل 1x. حُضنت التفاعلات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

تم فحص حساسية الإنزيم للحرارة بمعالجة 10 وحدات منه حراريًا لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية في محلول تفاعل بتركيز 1x. نُقل الإنزيم إلى تفاعلات تحتوي على ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بطول 1.1 كيلوبايت مُوسَم بـ 3H-dUTP، وقُيس نشاطه كما هو موضح في اختبار توصيف الوحدة. بعد المعالجة الحرارية، لم يتبقَّ من نشاط الإنزيم سوى أقل من 0.5%.

التطبيقات

- الوقاية من انتقال العدوى في اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- يزيل اليوراسيل من الحمض النووي

- ليندال، تي. وآخرون (1977) مجلة الكيمياء البيولوجية، 252، 10، 3286-3294.
- Longo, MC et al. (1990) Gene, 93, 125-128.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع