كياجين، G5030L، حساس للحرارة UNG (250 وحدة)

250 وحدة من إنزيم UNG غير المستقر حرارياً (0.25 مل عند 1000 وحدة/مل)

سمات

- يزيل اليوراسيل من الحمض النووي، تاركًا موقع AP
- لا يوجد نشاط على ركائز الحمض النووي الريبي
- يتم تعطيله تمامًا بالحرارة عن طريق حضانة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أعلى من 50 درجة مئوية
- نشاط نوعي عالٍ ونشاط قوي في درجة حرارة الغرفة

تفاصيل المنتج

تساهم إضافة إنزيم UNG إلى تفاعلات PCR وqPCR وRT-PCR في منع التلوث العابر الذي يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. يستفيد العملاء الذين يُجرون تحليلات متكررة بكميات كبيرة من إضافة إنزيم UNG إلى سير عملهم. وهو متوافق مع معظم محاليل تفاعل PCR وRT-PCR، وفعال ضمن نطاق واسع من المحاليل.

هذا المنتج هو نسخة أفضل مقارنة بـ Thermolabile UDG (G5020L).

متوفر في: 50 ملي مولار من Tris-HCl، 50 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار من DTT، 0.1 ملي مولار من EDTA، 50% جلسرين، درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية

أداء

الاختبار: المواصفات
نقاء SDS: >95%
الإكسونوكلياز أحادي السلسلة: <1.0%
إنزيم إكسونيوكلياز مزدوج السلسلة: <1.0%
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: أقل من 10 نسخ

الخصائص: درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية، الوزن الجزيئي: 51727 دالتون

مبدأ

إنزيمات يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG) هي عائلة فائقة من الإنزيمات (تضم 6 عائلات فرعية) تعمل على إصلاح الحمض النووي. إنزيم يوراسيل-إن-جليكوزيلاز (UNG) هو العائلة الأولى من عائلة UDG الفائقة، ويُشير UNG إلى الجين. يؤدي كل من UDG وUNG نفس الوظيفة البيولوجية، وهي إزالة اليوراسيل من الحمض النووي.

مصدر البروتين: سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية تحمل جينًا مستنسخًا لإنزيم يوراسيل-إن-جليكوزيلاز غير مستقر حراريًا

تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم UNG 2.0 غير المستقر حراريًا اللازمة لتحرير 1 نانومول من اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على dU في ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

إجراء

الخطوة*: °م
علاج UNG: 25
النسخ العكسي: 50
تعطيل النسخ العكسي والتمسخ الأولي: 94
درجة التمسخ: 94
التلدين/التمديد: 60

- اتبع إرشادات فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية

- استخدم الماصة برفق
- اخلط جيداً
- قم بتدوير الصفيحة بسرعة قبل تحميلها على الجهاز

تعليمات الاستخدام:

٢. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وفقًا للبروتوكول الحالي. إنزيم UNG المقاوم للحرارة (G5030-1000) متوافق مع معظم محاليل تفاعل PCR و RT-PCR.

3. أضف 1 ميكرولتر من إنزيم UNG الحراري (G5030-1000) لكل 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي، ثم رجّه جيدًا باستخدام جهاز الخلط الدوامي. يوضح الجدول أدناه مثالًا على إعداد تفاعل RT-qPCR أحادي الخطوة باستخدام إنزيم النسخ العكسي الخالي من RNase H (مثل Enzscript P7600L أو StableScript P7720L) وإنزيم Taq DNA بوليميراز ذو بدء ساخن قائم على الأجسام المضادة (مثل Phoenix Hot Start Taq P7590L).

*يجب على المستخدم النهائي تحديد درجة الحرارة والوقت الأمثلين للنسخ العكسي، وتعطيل النسخ العكسي وتنشيط Taq، بالإضافة إلى ظروف التلدين/التمديد.

ملاحظات: معالجة التفاعل بإنزيم UNG لمدة دقيقتين عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في بداية دورة التسخين والتبريد تزيل بقايا اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على dU، مما يمنعه من العمل كقالب. يمكن تعطيل إنزيم UNG الحساس للحرارة بسرعة أثناء النسخ العكسي عند درجات حرارة لا تقل عن 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

تحليل مراقبة الجودة:

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1X (70 ملي مولار Tris-HCl، 10 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار EDTA، 100 ميكروغرام/مل BSA، درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية) وأُضيفت إلى التفاعلات التي تحتوي على ناتج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بطول 1.1 كيلوبايت مُوسَم بـ 3H-dUTP في محلول تفاعل 1X. حُضنت التفاعلات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة الترسيب بحمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA).

يتم تحديد تركيز البروتين (OD 280) عن طريق قياس الامتصاص عند OD 280.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

التطبيقات

- منع انتقال العدوى في تفاعل البوليميراز المتسلسل
- إنشاء مواقع خالية من القواعد تحتوي على حمض نووي أحادي أو مزدوج السلسلة

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: