كياجين، L6020L، إنزيم ربط الحمض النووي T7 (900,000 وحدة)

900,000 وحدة من إنزيم T7 DNA Ligase (3,000,000 وحدة/مل) ومحلول الربط السريع 2x

سمات

- يربط فقط النهايات المتماسكة بكفاءة
- كفاءة منخفضة في وصل الأطراف غير الحادة
- إصلاح الشقوق أحادية السلسلة في الحمض النووي المزدوج

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم T7 DNA Ligase تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعة الفوسفات 5' ومجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي المزدوج. يربط هذا الإنزيم بكفاءة عالية النهايات المتماسكة فقط، ويصلح الشقوق في الحمض النووي المزدوج أحادي السلسلة. وهو غير فعال في تحفيز ربط النهايات غير المتماسكة. مع ذلك، يمكن إضافة تركيزات عالية من PEG 6000 بنسبة 20% أو أكثر (وزن/حجم) لتحفيز نشاط إنزيم T7 DNA Ligase، مما يؤدي إلى نتائج قابلة للقياس. عمومًا، في ظل ظروف التفاعل العادية، لا يستطيع إنزيم T7 DNA Ligase ربط نهايات الحمض النووي غير المتماسكة، مما يجعله خيارًا مناسبًا في الحالات التي توجد فيها نهايات متماسكة وغير متماسكة للحمض النووي، حيث لا يلزم ربط سوى النهايات المتماسكة.

يتم توفير هذا الإنزيم في 20 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من NaCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول الربط السريع 2x على 132 ملي مول من Tris-HCl، و20 ملي مول من MgCl2، و2 ملي مول من DTT، و2 ملي مول من ATP، و15% من PEG 6000؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 30,000 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 30,000 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 30,000 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 30000 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 41132 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين T7 DNA Ligase.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم T7 DNA Ligase اللازمة لربط 50% من 100 نانوغرام من شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة في 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية.

إجراء

- 10 ميكرولتر من محلول الربط السريع 2x (B1010)
- 50 نانوغرام من الحمض النووي الناقل
- زيادة مولية بمقدار 3 أضعاف من الحمض النووي المُدخل
- 1 ميكرولتر من إنزيم ربط الحمض النووي T7 (L6020L)
- ماء خالٍ من النيوكلياز حتى 20 ميكرولتر

تعليمات الاستخدام

ربط الأطراف اللاصقة للناقل المقطوع والقطعة المُدخلة. النسبة المولية الموصى بها للحمض النووي، الناقل: القطعة المُدخلة = 1:3

1. قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر (أضف الليغاز أخيرًا):

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.

3. اترك الناتج المربوط على الجليد، ثم انقل 1-5 ميكرولتر من الناتج إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المؤهلة. أو بدلاً من ذلك، يمكن تنقية ناتج الربط باستخدام الطريقة المناسبة أو تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

ملحوظات:

1. يُزوَّد إنزيم T3 DNA Ligase بمحلول ربط سريع بتركيز 2x لتفاعلات الربط. يكون النشاط منخفضًا جدًا في غياب البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (1).

2. لا يستطيع إنزيم T7 DNA Ligase ربط أجزاء الحمض النووي أحادي السلسلة (1).

3. يؤدي التعطيل الحراري إلى تقليل كفاءة التحويل بشكل كبير.

4. في غياب عوامل الازدحام عالية التركيز (على سبيل المثال، 20-30٪ PEG 6-8000)، يتم تقليل النشاط المحدد لـ T7 DNA Ligase بمقدار 1000 ضعف على الأجزاء ذات النهايات غير المتداخلة (1-2).

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. خُفف الإنزيم في محلول الربط السريع بتركيز 1x، ثم أُضيف إلى تفاعلات حجمها 20 ميكرولتر تحتوي على شظايا الحمض النووي المزدوجة ومحلول الربط السريع بتركيز 1x. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية تقريبًا، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت على هلام أجاروز بتركيز 1% مُلَوَّن ببروميد الإيثيديوم.

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- ربط الاستنساخ
- إضافة روابط أو محولات إلى الحمض النووي المزدوج
- إغلاق الشقوق في الحمض النووي المزدوج

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. Doherty, A. et al. (1996) J.Biol. Chem 271:11083.

2. دايال، ت. ملاحظات غير منشورة.