شركة كياجين، L6030-HC-L، إنزيم ربط الحمض النووي T4 (سريع)

240,000 وحدة من إنزيم T4 DNA Ligase (600,000 وحدة/مل) ومحلول ربط سريع بتركيز 2x ومحلول إنزيم T4 DNA Ligase بتركيز 10x

سمات

- يربط الأطراف غير الحادة والمتماسكة بكفاءة
- يُصلح الشقوق أحادية السلسلة في الحمض النووي المزدوج، والحمض النووي الريبي، والهجائن بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي
- إنزيم الربط المختار لتسلسل العمليات

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم T4 DNA Ligase تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعة الفوسفات الطرفية 5' ومجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي المزدوج (DNA أو RNA). يربط هذا الإنزيم بكفاءة النهايات غير المتداخلة والمتماسكة، ويصلح الشقوق أحادية السلسلة في الحمض النووي المزدوج (DNA أو RNA) أو هجائن DNA:RNA (1). يتوفر هذا الإنزيم في محلول يحتوي على 10 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من KCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% جلسرين، عند درجة حموضة 7.5 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول T4 DNA Ligase Buffer 10x على 500 مليمول من Tris-HCl، و100 مليمول من MgCl2، و50 مليمول من DTT، و10 مليمول من ATP؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول الربط السريع 2x على 132 ملي مولار من Tris-HCl، و20 ملي مولار من MgCl2، و2 ملي مولار من DTT، و2 ملي مولار من ATP، و15% من PEG 6000؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 6000 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 6000 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 6000 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 6000 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 55292 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين الإنزيمي المؤتلف بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين T4 DNA Ligase المستنسخ.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم T4 DNA Ligase المطلوبة لربط 50% من 100 نانوغرام من شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة في 50 ميكرولتر من محلول T4 DNA Ligase Buffer 1x بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية.

إجراء

الكاشف: الكمية
محلول ربط الحمض النووي T4 بتركيز 10x: 2 ميكرولتر
المتجه: المتغير
إدراج: متغير
إنزيم T4 DNA Ligase (120 وحدة/ميكرولتر): 1 ميكرولتر
مياه من النوع الأول: متغيرة
الحجم الكلي: 20 ميكرولتر

تعليمات الاستخدام

لإعداد التفاعل لـ T4 DNA Ligase (150,000 وحدة) و T4 DNA Ligase (240,000 وحدة).

١. انقل جميع المكونات المذكورة في الجدول أعلاه إلى وعاء تفاعل نظيف، واخلطها جيدًا باستخدام الماصة. ٢. حضّن المزيج عند درجة حرارة ٢٥ درجة مئوية لمدة ٣٠ دقيقة. ٣. نقِّ الحمض النووي (DNA) فورًا باستخدام أعمدة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ثم استخرجه في حجم ٥٠ ميكرولتر تقريبًا. ٤. أو بدلاً من ذلك، خفّف المحلول (بنسبة ١:١٠ على الأقل، مع التأكد من توفر ٠.١-١٠ نانوغرام من ناتج الربط للتحويل) فورًا في محلول TE أو الماء. ٥. حوّل ٠.١-١٠ نانوغرام من ناتج الربط إلى سلالة خلوية مؤهلة كيميائيًا أو كهربائيًا ومتوافقة مع الناقل.

ملحوظات

وحدة واحدة من وحدات التماسك الطرفية لإنزيم T4 DNA Ligase تعادل تقريبًا 3 وحدات تماسك طرفية كما تم قياسها باستخدام ركيزة جزء الحمض النووي Lambda-Hind III في محلول تفاعل T4 DNA Ligase 1x.

وحدة وايس واحدة تعادل تقريبًا 22 وحدة طرفية متماسكة من إنزيم ربط الحمض النووي T4.

إنزيم T4 DNA Ligase يعتمد على الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). نوصي بالتخلص من محلول التفاعل بعد عام واحد من التخزين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية واستبداله بمحلول جديد لضمان أعلى أداء.

تُعدّ عمليات الربط أحادية الإدخال مثالية عند استهداف نسبة إدخال إلى ناقل تتراوح بين 2 و6. تُعزز النسبة الأعلى من 6:1 إدخال أجزاء متعددة، بينما تُقلل النسبة الأقل من 2:1 من كفاءة الربط. في حالات الربط المُعقدة أو إذا كان تركيز الحمض النووي غير معروف، قد يكون من الضروري تغيير النسب وإجراء عمليات ربط متعددة. لا يحتوي مُخفف إنزيم ربط الحمض النووي T4 بتركيز 10x على بولي إيثيلين جلايكول (PEG) وهو متوافق مع بروتوكولات الربط القياسية التي لا تُحدد استخدام مُخفف سريع أو مُخفف مُكثف.

الأفضل: تنقية المنتج باستخدام عمود طرد مركزي لتنقية الحمض النووي، ثم استخلاصه في 50 ميكرولتر من محلول TE بعد الربط. أصبح الحمض النووي الآن جاهزًا للتحويل. يجب أن تتراوح كمية الحمض النووي المراد تحويلها بين 0.1 و10 نانوغرام.

الأفضل: تخفيف ناتج الربط في الماء المقطر أو محلول TE لتقليل تركيز البولي إيثيلين جلايكول. يجب أن تتراوح كمية الحمض النووي المراد تحويلها بين 0.1 و10 نانوغرام.

يُحفز استخدام إنزيم T4 DNA Ligase عالي التركيز، مع محلول الربط السريع 2x، معدل وكفاءة ربط النهايات غير المتداخلة بشكل كبير؛ لذا، لا يُنصح بفترات حضانة طويلة (أكثر من 10 دقائق) لأنها قد تُقلل بشكل ملحوظ من كفاءة تحويل نواتج الربط. يُوصى باتباع البروتوكول التالي لزيادة كفاءة تحويل تركيبة الإدخال/الناقل الصحيحة إلى أقصى حد.

لا يحتوي محلول الربط T4 DNA Ligase 10x على PEG وهو متوافق مع بروتوكولات الربط القياسية، والتي لا تحدد استخدام محلول التنسيق السريع.

المرجع 1. إنجلر، إم جيه، وريتشاردسون، سي سي (1982) بي دي بوير (محررون)، الإنزيمات، 5، ص. 3. سان دييغو: أكاديميك برس.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. خُفِّف الإنزيم في محلول منظم تفاعل ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1x، ثم أُضيف إلى تفاعلات حجمها 20 ميكرولتر تحتوي على قطعتين من الحمض النووي ومحلول منظم تفاعل ربط الحمض النووي T4 بتركيز 1x. حُضِّنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 23 درجة مئوية، ثم أُوقِفت، وحُلِّلت على هلام أجاروز بنسبة 1% مُلوَّن ببروميد الإيثيديوم.

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- الاستنساخ المقيد
- استنساخ TA
- ربط المحول
- بناء مكتبة NGS واستنساخها

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: