كياجين، L6050L، T4 RNA Ligase 1 (10000 وحدة)

20000 وحدة/مل و10X محلول منظم لربط الحمض النووي الريبي T4 (1 × 1.5 مل)

سمات

- ربط الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة والحمض النووي أحادي السلسلة المعتمد على الأدينوسين ثلاثي الفوسفات

تفاصيل المنتج

يقوم إنزيم T4 RNA Ligase بتحفيز الربط المعتمد على ATP للأحماض النووية أحادية السلسلة (RNA أو DNA) عن طريق ربط مانح الحمض النووي المنتهي بالفوسفور 5' بمستقبل الحمض النووي المنتهي بالهيدروكسيل 3' من خلال تكوين رابطة فوسفودايستر 3'→5' (1).

متوفر في: 10 ملي مولار Tris-HCl، 50 ملي مولار KCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية)

مرفق مع: 10X T4 RNA Ligase Buffer (B6050) : 500 mM Tris-HCl، 100 mM MgCl 2، 10 mM ATP، 100 mM DTT (pH 7.8 عند 25 درجة مئوية)

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 200 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 200 وحدة
تلوث بالريبونوكلياز: 200 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 43.5 كيلو دالتون

مبدأ

يتم إنتاج الإنزيم بواسطة سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين T4 RNA Ligase من العاثية T4.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لربط 50% من 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من اثنين من النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة 23 قاعدة (أحدهما مُفسفر عند 5′) في 20 ميكرولتر من محلول T4 RNA Ligase Buffer 1X بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
محلول منظم لربط الحمض النووي الريبي T4 بتركيز 10X (B6050): 1X
الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة ذو النهايات 5'P و3'OH: 200 نانوغرام - 1 ميكروغرام
مثبط إنزيم RNase (Y9240): 20 وحدة
T4 RNA Ligase 1 (L6050L): 10 ش
الحجم الكلي = 20 ميكرولتر

- حضّر مزيج التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر: المكونات التركيز النهائي الحجم ماء خالٍ من النيوكلياز N/AX ميكرولتر 10X محلول منظم لربط الحمض النووي الريبي T4 (B6050) 1X 2 ميكرولتر ssRNA ذو نهايات 5'P و3'OH 200 نانوغرام - 1 ميكروغرام X ميكرولتر مثبط RNase (Y9240) 20 وحدة 0.5 ميكرولتر إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 1 (L6050L) 10 وحدات 0.5 ميكرولتر الحجم الإجمالي = 20 ميكرولتر
- حضّن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.
- يمكن إيقاف التفاعل عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي قدره 12.5 ملي مولار أو التنظيف باستخدام طريقة تعتمد على عمود الدوران.

- بالنسبة للركائز أحادية السلسلة التي يصعب ربطها، يمكن تحسين كفاءة الربط عن طريق إضافة PEG بتركيز نهائي يتراوح بين 5 و10%.
- بالنسبة لركائز الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة الأطول، يمكن أن يؤدي الحضانة طوال الليل عند درجة حرارة 16 درجة مئوية إلى تحسين الإنتاجية.

تعليمات الاستخدام

تكوين حلقات الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة

ملحوظات:

ضبط الجودة

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 20 ميكرولتر تحتوي على 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من اثنين من أوليغونوكليوتيدات RNA أحادية السلسلة مكونة من 23 قاعدة (أحدهما مُفسفر عند الطرف 5') ومحلول منظم تفاعل T4 RNA Ligase بتركيز 1X. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم أُوقفت وحُللت على هلام TBE-يوريا بتركيز 15% مُلَوَّن بصبغة SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen S-11494). يُحدد تركيز البروتين (OD 280) بقياس الامتصاص عند OD 280. تُقيّم النقاوة الفيزيائية بواسطة SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعًا بالكشف باستخدام صبغة الفضة. يُقيّم نقاء العينة بمقارنة الكتلة الإجمالية للشوائب في العينة المركزة بكتلة البروتين المطلوب في العينة المخففة. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يُحدد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلاسل في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يُقيّم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة حجمها 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم بعد فصل سلسلتي الحمض النووي، ثم تُفحص في اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي TaqMan للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المطابقة لموقع الحمض النووي الريبوزي 16S. يُقيّم التلوث غير النوعي بالريبونوكلياز باستخدام مجموعة RNase Alert (من شركة Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- ربط الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة والحمض النووي أحادي السلسلة
- وسم النهايات 3' للحمض النووي الريبي

- سيلبر، ر. وآخرون (1972) وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية، 69 (10): 300-3013.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع