كياجين، L6070L، T4 RNA Ligase 2 Truncated (500 U)

500 وحدة (عبوة تقييم) T4 RNA Ligase 2 Truncated (5000 وحدة/مل) و 10X T4 RNA Ligase 2، Truncated Buffer (1 × 1.5 مل).

سمات

- يربط على وجه التحديد الطرف 5' من الحمض النووي DNA أو RNA المضاف إليه الأدينين مسبقًا بالطرف 3' من الحمض النووي RNA.
- على عكس الليغاز كامل الطول، فإنه غير قادر على ربط الطرف 5' المفسفر من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي بالطرف 3' من الحمض النووي الريبي.
- لا يتطلب الربط ATP، ولكن هناك حاجة إلى ركيزة مُسبقة الأدينيل.
- يقلل من ربط الخلفية عن طريق استخدام الروابط المؤدينة مسبقًا فقط.

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم T4 RNA Ligase 2 المختزل تكوين الرابطة الفوسفودايسترية بين مجموعة فوسفات 5' مُسبقة الأدينيل (في الحمض النووي DNA أو RNA) ومجموعة الهيدروكسيل 3' في RNA. يحتوي هذا الإنزيم المختزل على أول 249 حمضًا أمينيًا فقط من إنزيم T4 RNA Ligase 2 كامل الطول، مما يجعله لا يحتاج إلى مانح طرفي 5' مُسبق الأدينيل، ويُغني عن الحاجة إلى ATP. ولأن إنزيم T4 RNA Ligase 2 المختزل لا يستطيع استخدام مجموعة الفوسفات 5' في RNA أو DNA كمانح في تفاعل الربط، فإنه يُعد مفيدًا في تطبيقات معينة، مثل ربط الوصلات بين DNA 5' مُسبق الأدينيل وRNA 3' هيدروكسيل. تُعزز نواتج الربط المطلوبة بشكل كبير مقارنةً بنواتج الربط غير المرغوب فيها، مما يجعل الإنزيم المختزل متفوقًا على الإنزيم كامل الطول في هذا الاستخدام. وبالتالي، فإن هذا الإنزيم هو خيار ممتاز لإعداد مكتبة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي (1-5).

متوفر في: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية)

مرفق مع: 10X T4 RNA Ligase 2، محلول منظم مختصر (B6070): 500 مليمولار Tris-HCl، 100 مليمولار MgCl2، 50 مليمولار DTT (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية)

أداء

الاختبار: المواصفات
نقاء SDS: >99%
النشاط النوعي: 30,000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: أقل من 5.0% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: أقل من 1.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: أقل من 10 نسخ
إنزيم الريبونوكلياز غير النوعي: لم يتم الكشف عن أي إنزيم ريبونوكلياز غير نوعي

الخصائص: درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

مبدأ

مصدر البروتين: تم تنقيته من سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تعبر عن جين T4 RNA Ligase 2 المختصر المؤتلف.

تعريف الوحدة: تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لربط 50% من 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من RNA أحادي السلسلة 5' FAM-labeled 17-mer إلى الطرف 5' pre-adenylated من DNA 18-mer عندما يتم تلدين كلا 17-mers مع سلسلة DNA مكملة 35-mer في 20 ميكرولتر من محلول التفاعل 1X بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

الوزن الجزيئي: 30451 دالتون

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
10X T4 RNA Ligase 2، محلول تفاعل مختصر (B6070): 1X
3' OH RNA: 1 ميكرومول
الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المُسبق الأدينيل في الطرف 5': 2 ميكرومول
إنزيم T4 RNA Ligase 2، المختصر (L6070L): 5 وحدات
الحجم الكلي = 20 ميكرولتر

- حضّر مزيج التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر: المكونات التركيز النهائي الحجم ماء خالٍ من النيوكلياز N/AX ميكرولتر 10X T4 RNA Ligase 2، محلول تفاعل مختصر (B6070) 1X 2 ميكرولتر 3' OH RNA 1 ميكرومول X ميكرولتر 5' pre-adenylated DNA or RNA 2 ميكرومول X ميكرولتر T4 RNA Ligase 2، مختصر (L6070L) 5 وحدات 1 ميكرولتر الحجم الإجمالي = 20 ميكرولتر
- حضّن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- يمكن إيقاف التفاعل عن طريق إضافة EDTA أو الحضانة عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

تعليمات الاستخدام: ربط مجموعة الهيدروكسيل 3' من الحمض النووي الريبي (RNA) مع الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) المُسبق الأدينيل 5'

تحليل مراقبة الجودة: تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1X، وأُضيف 2 ميكرولتر من كل تخفيف إنزيمي إلى 18 ميكرولتر من التفاعلات في محلول تفاعل 1X يحتوي على 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من أوليغونوكليوتيد RNA مكون من 17 قاعدة (موسوم بـ FAM عند الطرف 5') وأوليغونوكليوتيد DNA مكون من 18 قاعدة (مُسبق الأدينيل عند الطرف 5') مرتبط بأوليغونوكليوتيد DNA مكمل مكون من 35 قاعدة. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم أُوقفت، وحُللت على هلام TBE-يوريا بنسبة 15%.

يتم تحديد تركيز البروتين (OD 280) عن طريق قياس الامتصاص عند OD 280.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

يتم تقييم التلوث غير المحدد بالـ RNAse باستخدام مجموعة RNAse Alert Kit (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- بناء مكتبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي
- زيادة القدرة على تحديد الحمض النووي الريبوزي الميكروي (miRNAs)

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع:

١. هو، سي كيه وآخرون (٢٠٠٤) ستراكشر، ١٢، ٣٢٧-٣٣٩. ٢. هو، سي كيه وشومان، إس (٢٠٠٢) وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية، ٩٩، ١٢٧٠٩-١٢٧١٤. ٣. ناندكومار، جيه وآخرون (٢٠٠٤) مجلة الكيمياء البيولوجية، ٢٧٩، ٣١٣٣٧-٣١٣٤٧. ٤. أرافين، إيه وتوش، تي (٢٠٠٥) رسائل الاتحاد الأوروبي لجمعيات الكيمياء الحيوية، ٥٧٩، ٥٨٣٠-٥٨٤٠. ٥. فايفر، إس وآخرون (٢٠٠٥) طرق الطبيعة، ٢، ٢٦٩-٢٧٦.