كياجين، L6080L، T4 RNA Ligase 2 (4500 U)

4500 وحدة من T4 RNA Ligase 2 (30000 وحدة/مل) ومحلول الربط 10X (1 × 1.5 مل)

سمات

- يربط الشقوق الموجودة على الحمض النووي الريبي المزدوج
- يربط مجموعة الفوسفات 5' ومجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي الريبي

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم T4 RNA Ligase 2 تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين طرف الفوسفات 5' وطرف الهيدروكسيل 3' لجزيء RNA. الركيزة المفضلة هي RNA مزدوج السلسلة ذو شقوق، ولكن يمكن أيضًا ربط أنواع أخرى من هجائن الأحماض النووية ذات الشقوق. يتطلب إنزيم T4 RNA Ligase 2 وجود ATP للنشاط ما لم تكن الركيزة مُسبقة الأدينيلات على الطرف 5' (1-5).

متوفر في: 10 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 50% جلسرين (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية)

المرفقات: محلول الربط 10X (B6030): 500 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار MgCl2، 50 ملي مولار DTT، 10 ملي مولار ATP (الأس الهيدروجيني 7.6 عند 25 درجة مئوية)

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: 500 وحدة
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 500 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 500 وحدة
تلوث RNase: 500 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 37.6 كيلو دالتون

مبدأ

يتم تنقية الإنزيم من سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تعبر عن جين T4 RNA Ligase 2 المؤتلف.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لربط 50% من 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة 5' FAM-labeled 17-mer إلى الطرف 5' المفسفر من الحمض النووي DNA 18-mer عندما يتم تلدين كلا السلسلتين مع سلسلة DNA مكملة 35-mer في 20 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
محلول منظم لربط الحمض النووي الريبي T4 بتركيز 10X (B6030): 1X
ركيزة الحمض النووي الريبي المزدوج المقطوع: 1 ميكرومتر
T4 RNA Ligase 2 (L6080L): 10 ش
الحجم الكلي = 20 ميكرولتر

- حضّر مزيج التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر: المكونات التركيز النهائي الحجم ماء خالٍ من النيوكلياز N/AX ميكرولتر 10X محلول منظم لربط الحمض النووي الريبي T4 (B6030) 1X 2 ميكرولتر ركيزة الحمض النووي الريبي المزدوج المقطوع 1 ميكرومول X ميكرولتر إنزيم ربط الحمض النووي الريبي T4 2 (L6080L) 10 وحدات 0.33 ميكرولتر الحجم الإجمالي = 20 ميكرولتر
- حضّن عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- يمكن إيقاف التفاعل عن طريق إضافة EDTA والحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو التنظيف باستخدام طريقة تعتمد على عمود الدوران.

تعليمات الاستخدام

ربط النيك في الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة

ضبط الجودة

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1X، وأُضيف 2 ميكرولتر من كل تخفيف إنزيمي إلى 18 ميكرولتر من التفاعلات في محلول تفاعل 1X يحتوي على 0.4 ميكروغرام من مزيج متساوي المولات من أوليغونوكليوتيد RNA مكون من 17 قاعدة (موسوم بـ FAM عند الطرف 5') وأوليغونوكليوتيد DNA مكون من 18 قاعدة (مُفسفر عند الطرف 5') مرتبط بأوليغونوكليوتيد DNA مكمل مكون من 35 قاعدة. حُضنت التفاعلات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ثم أُوقفت وحُللت على هلام TBE-يوريا بنسبة 15%.

يتم تحديد تركيز البروتين (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

يتم تقييم التلوث غير المحدد بـ RNase باستخدام مجموعة RNase Alert (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- ربط الشق في الحمض النووي الريبي ثنائي السلسلة
- ربط مجموعة الهيدروكسيل 3' من الحمض النووي الريبي بمجموعة الفوسفات 5' من الحمض النووي في بناء مكتبة الحمض النووي الريبي NGS بتنسيق مزدوج السلاسل (miRNA-seq أو mRNA-seq الاتجاهي)

- هو، سي كيه وآخرون. (2004) البنية، 12، 327-339.
- Ho, CK and Shuman, S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12709-12714.
- نانداكومار، J. وآخرون. (2004) ج. بيول. كيم.، 279، 31337-31347.
- أرافين، أ. وتوش، ت. (2005) رسائل FEBS، 579، 5830-5840.
- Pfeffer, S. et al. (2005) Nat. Meth., 2, 269-276.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع