كياجين، L6090L، إنزيم ربط الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية (2500 وحدة)

2500 وحدة من إنزيم ربط الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية (10000 وحدة/مل) ومحلول تفاعل إنزيم ربط الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية بتركيز 10x

سمات

- يربط الحمض النووي عند الشقوق والنهايات المتماسكة
- يتطلب NAD+

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم ربط الحمض النووي في بكتيريا الإشريكية القولونية تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعة فوسفات 5' متجاورة ومجموعة هيدروكسيل 3' في نهايات الحمض النووي، ويتطلب ذلك وجود NAD+ وMg2+ كعوامل مساعدة. وتُعد عملية ربط نهايات الحمض النووي غير المتداخلة غير فعالة للغاية مقارنةً بربط نهايات الحمض النووي المتماسكة وإصلاح الشقوق.

يتم توفير هذا الإنزيم في محلول يحتوي على 10 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من KCl، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول تفاعل ربط الحمض النووي E. coli بتركيز 10x على 300 ملي مولار Tris-HCl، و40 ملي مولار MgCl2، و260 ميكرومولار NAD، و10 ملي مولار DTT، و0.5 مليغرام/مل BSA عند درجة حموضة 8.0 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 100 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 50 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 73606 دالتون

مرجع

ليمان آي آر (1974) العلوم 186، 790-797.

مبدأ

يتم إنتاج البروتين الإنزيمي المؤتلف بواسطة بلازميد يحتوي على الجين الذي يرمز إلى إنزيم ربط الحمض النووي E. coli في E. coli.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية إنزيم ربط الحمض النووي E. coli المطلوبة لربط 50% من 100 نانوغرام من شظايا الحمض النووي ذات النهايات المتماسكة في 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.

إجراء

- 2 ميكرولتر من محلول منظم لربط الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية بتركيز 10x (B6090)
- ما يصل إلى 5 ميكروغرام من الحمض النووي
- 1 ميكرولتر (10 وحدات) من إنزيم ربط الحمض النووي E. coli (L6090L)
- ماء خالٍ من النيوكلياز حتى 20 ميكرولتر

تعليمات الاستخدام

1. قم بإعداد خليط تفاعل سد الشقوق التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر:

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

3. أوقف التفاعل عن طريق التعطيل الحراري عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ضبط الجودة

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- استنساخ الحمض النووي التكميلي عن طريق التخليق الاستبدالي

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. ليمان، آي آر (1974) العلوم، 186، 790-797.