كياجين، P7010-HC-L، جزء كلينو (3'→5' exo–) (تركيز عالٍ)

10000 وحدة من كلينو (3'→5' exo–) (0.2 مل عند 50000 وحدة/مل) و10X Blue Buffer (2 × 1.5 مل)

سمات

- بوليميراز الحمض النووي الذي يفتقر إلى أنشطة التدقيق (3'→5') وترجمة النيك (3'→5')
- يحتفظ بنشاط قوي لبوليميراز الحمض النووي 3'→5'
- يستخدم في تفاعلات الوسم الفلوري للمصفوفات الدقيقة
- الأفضل لإضافة ذيول dA و dT لربط المحولات بقطع الحمض النووي لتسلسل الجيل التالي

تفاصيل المنتج

جزء كلينو (3'→5' exo-) هو جزء كبير من بوليميراز الحمض النووي الأول (جزء كلينو) الذي تم تعطيله ليصبح غير قادر على القيام بنشاطي النيوكلياز في كل من التدقيق (3'→5') وترجمة الشقوق (3'→5'). جزء كلينو (3'→5' exo-) هو بوليميراز حمض نووي محب للحرارة المعتدلة، ويُظهر نشاط إزاحة معتدل للسلسلة أثناء تخليق الحمض النووي.

يتم توفير الإنزيم في 20 ملي مولار من Tris-HCl، 1 ملي مولار من DTT، 0.1 ملي مولار من EDTA، 50% جلسرين عند درجة حموضة 7.5 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

يتم تزويد الإنزيم بمحلول أزرق 10X (B0110) يحتوي على 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و100 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من MgCl2، و10 ملي مولار من DTT؛ درجة الحموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 10000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 500 وحدة <10% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلسلة: 500 وحدة <1% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 500 وحدة <10 نسخ
نشاط إنزيم UDG: أقل من 20 وحدة/مل

مبدأ

إن بوليميراز الحمض النووي الأول عبارة عن سلسلة ببتيدية واحدة تتكون من حوالي 930 حمض أميني. يمتلك الإنزيم الكامل ثلاث وظائف: بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي من 5' إلى 3'، والتدقيق من 3' إلى 5'، والإنزيم الخارجي من 3' إلى 5' (المعروف أيضًا باسم الإنزيم الداخلي للطرف).

إن نشاط الإكسونوكلياز 5'→3' لبوليميراز الحمض النووي الأول في بكتيريا الإشريكية القولونية يجعله غير مناسب لبعض التطبيقات. تتمثل المهمة الرئيسية لهذا النشاط في إزالة بادئات الحمض النووي الريبي (RNA) من الطرف 5' للحمض النووي المُصنّع حديثًا، مما يسمح لنشاط البوليميراز بملء الفجوات الناتجة. يُستخدم نشاط النيوكلياز 3'→5' أثناء إصلاح الحمض النووي، وهو ضروري لتطبيقات إنزيمية مثل ترجمة الشقوق. يُعد هذا النشاط غير مرغوب فيه لتسلسل الحمض النووي وتطبيقات أخرى، نظرًا لقدرة الإكسونوكلياز 5'→3' على تحليل البنى المتدلية، والحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة من الأطراف الحرة 5'→5'. يفتقر جزء كلينو من بوليميراز الحمض النووي الأول في بكتيريا الإشريكية القولونية إلى نشاط الإكسونوكلياز 5'، ولكنه يحتفظ بنشاط البوليميراز 5'→3' ونشاط الإكسونوكلياز 3'→5' لإزالة النيوكليوتيدات قبل الترميز والتدقيق.

كما أن نشاط الإكسونوكلياز 5'→3' لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الأول في بكتيريا الإشريكية القولونية قد يكون غير مرغوب فيه، فإن نشاط التدقيق اللغوي للإكسونوكلياز 3'→5' لجزء كلينو قد يكون غير مرغوب فيه أيضًا في بعض الحالات. يتم التغلب على هذه المشكلة بإدخال طفرات تُنتج إنزيم جزء كلينو (إكسونوكلياز 3'→5') الذي يحتفظ بنشاط البوليميراز 5'→3' ولكنه يفتقر إلى أي نشاط إكسونوكلياز. قد تُضيف بوليميرازات الحمض النووي التي تفتقر إلى إكسونوكلياز 3'→5' نيوكليوتيدًا واحدًا غير معتمد على القالب إلى الطرف 3' من التسلسل (إضافة ذيل) مع تفضيل لـ dATP اعتمادًا على ظروف التفاعل وسياق التسلسل.

تُعدّ عملية إضافة ذيل dA (أو dT) إلى الحمض النووي خطوةً مهمةً في عملية ربط محولات الحمض النووي بقطع الحمض النووي. ويُستخدم هذا الإجراء بكثرة في تحضير مكتبات الحمض النووي لتسلسل الجيل التالي. كما يُستَخدَم عمل جزء كلينو (3'→5' exo-) في بعض تفاعلات الوسم الفلوري للمصفوفات الدقيقة.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام جزء كلينو (3'→5' exo-) في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط وحدة إنزيم كلينو (3'→5' exo-) باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تخزين كلينو (3'→5' exo-) يحتوي على الجلسرين (50%)، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، ومحلول منظم أزرق بتركيز 1X، و3H-dTTP، و100 ميكرومول من dNTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

تم تحديد تركيز البروتين لجزء كلينو (3'→5' exo-) (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

تم تقييم النقاء الفيزيائي لجزء كلينو (3'→5' exo-) باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل إنزيمية مركزة ومخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية للأشرطة الملوثة في العينة المركزة بكتلة شريط البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في جزء كلينو (3'→5' exo-) في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. كما تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في جزء كلينو (3'→5' exo-) في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. أما نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في جزء كلينو (3'→5' exo-)، فقد تم تحديده في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على 0.5 ميكروغرام من DNA البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم تلوث E. coli لجزء Klenow (3'→5' exo-) باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لـ E. coli باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

تم تقييم تلوث جزء كلينو (3'→5' exo-) بإنزيم يوراسيل دي إن إيه جليكوزيلاز (UDG) في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على حمض نووي يوراسيل مشع بالتريتيوم و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، وتم تحضينه لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف توصيف وحدة UDG القياسية.

التطبيقات

- التطبيقات الرئيسية: خيار مثبت لوسم الحمض النووي (DNA) وإضافة ذيل dA وذيل dT لربط محولات التسلسل من الجيل التالي
- خيار مُثبت لتوسيم الحمض النووي
- إضافة ذيل dA وذيل dT لربط محولات التسلسل من الجيل التالي
- تطبيقات أخرى: تسلسل الحمض النووي ثنائي الديوكسي لقوالب الحمض النووي أحادية أو ثنائية السلسلة، وتخليق السلسلة الثانية من الحمض النووي المكمل (cDNA)، وتوليد مجسات الحمض النووي أحادية السلسلة باستخدام بادئات عشوائية، والطفرات الموجهة للموقع في الحمض النووي باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية.
- تسلسل الحمض النووي ثنائي الديوكسي لقوالب الحمض النووي أحادية أو ثنائية السلسلة
- تخليق السلسلة الثانية من الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- توليد مجسات الحمض النووي أحادي السلسلة باستخدام البادئات العشوائية
- الطفرات الموجهة للموقع في الحمض النووي باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية

- خيار مُثبت لتوسيم الحمض النووي
- إضافة ذيل dA وذيل dT لربط محولات التسلسل من الجيل التالي

- تسلسل الحمض النووي ثنائي الديوكسي لقوالب الحمض النووي أحادية أو ثنائية السلسلة
- تخليق السلسلة الثانية من الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- توليد مجسات الحمض النووي أحادي السلسلة باستخدام البادئات العشوائية
- الطفرات الموجهة للموقع في الحمض النووي باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: