كياجين، P7020-HC-L، بوليميراز الحمض النووي Phi29 (تركيز عالٍ)

2000 وحدة من بوليميراز الحمض النووي phi29 (0.020 مل عند 100000 وحدة/مل) و10x محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي phi29 (1 × 1.5 مل)

سمات

- بوليميراز الحمض النووي عالي الكفاءة
- نشاط إزاحة قوي للخيوط
- نشاط الإكسونوكلياز 3'→5' (التدقيق اللغوي)

تفاصيل المنتج

إنزيم بوليميراز الحمض النووي Phi29 مسؤول عن تضاعف عاثية Bacillus subtilis Phi29 (1). يتميز هذا الإنزيم بقدرة عالية على معالجة الحمض النووي (يصل إلى 70,000 قاعدة مُضافة لكل عملية ارتباط) مع نشاط قوي في إزاحة السلسلة (2) ووظيفة إكسونوكلياز عالية الدقة من 3ʹ→5ʹ (3)، مما يجعله مثاليًا للتضخيم متساوي الحرارة.

يتم توفير الإنزيم في محلول يحتوي على 10 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من KCl، و0.1 ملي مولار من EDTA، و1 ملي مولار من DTT، و0.5% من Tween-20، و0.5% من NP-40، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي Phi29 10X (رقم المنتج B7020) على ما يلي: 500 ملي مولار Tris-HClm 100 ملي مولار (NH 4 ) 2 SO 4 ، 40 ملي مولار DTT و 100 ملي مولار MgCl 2 ؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

استفسر عن التركيبات المتوافقة مع لوائح REACH.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 83,333 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونيوكلياز أحادي السلسلة: وظيفي
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة: لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 100 وحدة؛ 83333 وحدة/ملغ

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- نشاط الإكسونوكلياز: 3'→5'
- الوزن الجزيئي: 66713 دالتون

- بلانكو، ل.، وسالاس، م. (1984) وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم 81:5325.
- بلانكو، L.، وآخرون. (1989) ج. بيول. الكيمياء. 264:8935.
- جارمنديا، سي، وآخرون. (1992) ج. بيول. الكيمياء. 267:2594.

ملكيات

مراجع

مبدأ

مصدر البروتين الإنزيمي المؤتلف: يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين بوليميراز الحمض النووي Phi29 من العاثية Phi29.

تعريف الوحدة: يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية البوليميراز المطلوبة لتحويل 0.5 بيكومول من dTTP إلى مادة غير قابلة للذوبان في الحمض في 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.

إجراء

تم قياس نشاط وحدة تحليل مراقبة الجودة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم لتفاعل بوليميراز الحمض النووي Phi29 بتركيز 1x، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على الحمض النووي λ Hind III، ومحلول منظم لتفاعل بوليميراز الحمض النووي Phi29 بتركيز 1x، و3H-dTTP، و0.2 ميكرومول من dTTP، و200 ميكرومول من dATP وdCTP وdGTP. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 30 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، المجلد 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- التضخيم متساوي الحرارة
- تضخيم الجينوم الكامل (WGA)
- تضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA)
- تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA)