شركة كياجين، P7040L، إنزيم النسخ العكسي M-MuLV

100,000 وحدة (عبوة تقييم) من إنزيم النسخ العكسي M-MuLV (0.50 مل عند 200,000 وحدة/مل) و10X M-MuLV RT Buffer (2 × 1.5 مل)

سمات

- تقدم شركة QIAGEN خدمات تصنيع كميات كبيرة من إنزيم النسخ العكسي M-MuLV بتركيبات مخصصة.
- بوليميراز من فيروس سرطان الدم الفأري مولوني
- نطاق RNase H الوظيفي

تفاصيل المنتج

إنزيم النسخ العكسي M-MuLV هو بوليميراز DNA يستخدم RNA كركيزة، ولا يُظهر وظيفة تصحيحية قابلة للقياس من 3ʹ إلى 5ʹ كإنزيم إكسونيوكلياز. يستطيع هذا الإنزيم إجراء عملية تخليق cDNA عن طريق إطالة بادئ DNA مرتبط بقالب RNA، كما يمكنه نسخ قالب DNA أحادي السلسلة. يمكن لنطاق RNase H أن يعمل بشكل مستقل عن نشاط البوليميراز. قد يُحدّ التنافس بين نشاطي البوليميراز وRNase H من كفاءة تخليق cDNA. قد يعمل بادئ DNA أو cDNA غير مكتمل من الدوبلكس المتكون كركيزة لـ RNase H.

يتم توفير الإنزيم في 50 ملي مولار Tris-HCl، 150 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، 0.1% NP-40 البديل و50% جلسرين؛ درجة الحموضة 7.6 عند 25 درجة مئوية.

يرجى الاستفسار عن التركيبات المتوافقة مع لوائح REACH.

يحتوي محلول 10x M-MuLV RT Buffer (رقم المنتج B7040) على 500 ملي مولار Tris-HCl، و750 ملي مولار KCl، و30 ملي مولار MgCl2، و100 ملي مولار DTT؛ درجة الحموضة 8.3 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 169000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونيوكلياز أحادي السلسلة: 2000 وحدة <5.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 2000 وحدة؛ أقل من 1.0% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 2000 وحدة؛ لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 2000 وحدة؛ أقل من 10 نسخ
تلوث بإنزيم RNase: 2000 وحدة؛ لا يوجد إنزيم RNase غير محدد قابل للكشف

ملكيات

درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية. درجة حرارة التفاعل الموصى بها: أقل من 42 درجة مئوية. طول النسخ: الحمض النووي التكميلي (cDNA) حتى 7 كيلوبايت. الوزن الجزيئي: 68100 دالتون.

مبدأ

مصدر البروتين هو سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم الفأري مولوني.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام poly r(A)/oligo (dT) كركيزة.

إجراء

الكمية: الوصف
1 ميكرولتر: محلول dNTP بتركيز 25 ملي مولار (رقم المنتج N2050L)
المتغير: 1-2 ميكروغرام إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) أو 5-500 نانوغرام مرنا (بولي-A محدد)
1 ميكرولتر: أوليجو (dT) 12-18 (50 ميكروغرام/مل) أو بادئات عشوائية (125 ميكروغرام/مل) أو بادئ GSP (2 بيكومول)
ماء خالٍ من النيوكلياز لرفع الحجم الإجمالي إلى 10 ميكرولتر.

تخليق السلسلة الأولى

1. عملية تلدين البادئات: اجمع المكونات التالية في وعاء تفاعل خالٍ من إنزيم RNase:

٢. سخّن التفاعل لمدة ٥ دقائق عند ٦٥ درجة مئوية. قم بالتدوير لفترة وجيزة (٥ ثوانٍ) لفصل المكثفات، ثم ضعه فورًا على الثلج. ٣. أضف ١ ميكرولتر من محلول M-MuLV RT Buffer بتركيز ١٠ أضعاف (رقم المنتج B7040) وماءً خاليًا من النيوكلياز ليصل الحجم النهائي إلى ١٠ ميكرولتر لكل تفاعل. ٤. حضّن المزيج كما يلي: • في حال استخدام بادئات أوليجو (dT) أو GSP، لمدة دقيقتين عند ٤٢ درجة مئوية. • في حال استخدام بادئات عشوائية، لمدة دقيقتين عند ٢٥ درجة مئوية. ٥. أضف ١ ميكرولتر (٢٠٠ وحدة) من إنزيم النسخ العكسي M-MuLV (رقم المنتج P7040) واخلط المزيج عن طريق سحب العينة برفق باستخدام الماصة. (ملاحظة: في حال استخدام بادئات عشوائية، حضّن التفاعل مسبقًا عند ٢٥ درجة مئوية لمدة ١٠ دقائق). ٦. حضّن المزيج عند ٤٢ درجة مئوية لمدة ٤٥-٦٠ دقيقة. 7. قم بتعطيل الإنزيم عند درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. 8. خزّن المنتجات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية.

تحليل مراقبة الجودة

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تُحضّر تخفيفات الإنزيم في محلول منظم M-MuLV RT بتركيز 1x، وتُضاف إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على 20 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين (poly r(A))، وحمض نووي أوليغو (dT)، ومحلول منظم RT بتركيز 1x، و3H-dTTP، و250 ميكرومول من dTTP. تُحضن التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم توضع على الجليد، وتُحلل باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، المجلد 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة Bio-Rad Protein Assay Kit II (رقم الكتالوج 500-0002).

يتم قياس تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية في عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات التي تتوافق مع موضع الحمض النووي الريبوزي 16S.

يستخدم اختبار RNase غير المحدد مجموعة RNase Alert (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

التطبيقات

• تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) • تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)