كياجين، P7060L، جزء كلينو (2500 وحدة)

2500 وحدة من جزء كلينو (0.5 مل عند 5000 وحدة/مل) و10x محلول أزرق منظم (1 × 1.5 مل)

سمات

- بوليميراز الحمض النووي المحب للحرارة المعتدلة
- لا يوجد نشاط إكسونوكلياز 5'➞3'
- يحتفظ بنشاط الإكسونوكلياز 3'➞5' مع إظهار إزاحة معتدلة للسلسلة

تفاصيل المنتج

إنزيم كلينو فراجمنت هو بوليميراز DNA محب للحرارة المعتدلة، مشتق من إنزيم بوليميراز I الخاص بإصلاح الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي في بكتيريا الإشريكية القولونية. يُظهر هذا الإنزيم نشاطًا نوكليازيًا في تخليق الحمض النووي وتصحيحه (3ʹ→5ʹ)، وفي غياب نطاق النوكلياز (5ʹ→3ʹ) الخاص بالإنزيم الكامل، يُظهر نشاطًا معتدلًا في إزاحة السلسلة أثناء تخليق الحمض النووي. يُعبَّر عن البروتين كمنتج جيني مُختزل لجين PolA في بكتيريا الإشريكية القولونية.

يتم توفير الإنزيم في 100 ملي مولار من KPO4، و1.0 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.4 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي المحلول المنظم المعروف باسم 10x Blue Buffer على درجة حموضة تبلغ 7.9 عند 25 درجة مئوية ويتضمن 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و100 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من MgCl2، و10 ملي مولار من DTT.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 5000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 50 وحدة؛ وظيفي
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة؛ فعال
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة؛ لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 50 وحدة؛ أقل من 10 نسخ

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 68202 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين Klenow Fragment.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية البوليميراز اللازمة لتحويل 10 نانومول من dNTPs إلى مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

- قم بإذابة الحمض النووي في محلول أزرق بتركيز 1x (B0110)
- أضف dNTPs (كل منها بتركيز نهائي قدره 33 ميكرومتر)
- أضف وحدة واحدة من جزء كلينو لكل ميكروغرام من الحمض النووي

تعليمات الاستخدام

1. قم بإعداد خليط التفاعل التالي:

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

3. أوقف التفاعل بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 10 مليمولار) والتسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تخزين كلينو (3ʹ→5ʹ exo–) بنسبة 50% من الجلسرين، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، ومحلول منظم لتفاعل كلينو بتركيز 1x، و3H-dTTP، و100 ميكرومول من dNTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- التذييل لتسلسل الجيل التالي
- تضخيم إزاحة الخيط
- وسم الحمض النووي
- إزالة الأجزاء البارزة بطول 3 أقدام وردم الأجزاء البارزة بطول 5 أقدام

- جاكوبسن، H. وآخرون. (1974) يورو. جيه بيوكيم، 45، 623-627.
- Sambrook, J. and Russell, DW (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., v3, A8.25-A8.26.
- Sambrook, J. et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., (2nd ed.), 5.40-5.43.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع