شركة كياجين، P7070L، ناقلة ديوكسي نولسيوتيديل الطرفية (TdT) (6000 وحدة)

6000 وحدة من إنزيم ناقل النيوكليوتيد الطرفي (TdT) (0.30 مل عند 20000 وحدة/مل) و10x محلول منظم أخضر (1 × 1.5 مل) و2.5 ملي مول من كلوريد الكوبالت (1 × 1.5 مل).

سمات

- يعمل بكفاءة على إطالة الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA أحادي السلسلة ذي النهاية غير الحادة والمتدلية من الطرف 5'
- مفيد لوضع العلامات على مسافة 3 أقدام
- يدمج dATP و dTTP بكفاءة أعلى بخمسة أضعاف من dCTP و dGTP

تفاصيل المنتج

إنزيم ناقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي (TdT) هو بوليميراز DNA مستقل عن القالب، يحفز إضافة ديوكسي نيوكليوتيدات إلى الطرف الهيدروكسيلي 3' لجزيئات DNA أحادية أو مزدوجة السلسلة. وجود 1 ملي مول من أيونات الكوبالت (Co²⁺) يحفز إضافة ذيول إلى النهايات 3' لقطع DNA (1،2).

متوفر في: 50 ملي مولار KPO₄، 100 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Triton X-100، 50% جلسرين (الأس الهيدروجيني 7.3 عند 25 درجة مئوية). مرفق مع: محلول منظم أخضر 10X (B0120): 200 ملي مولار Tris-Acetate، 500 ملي مولار أسيتات البوتاسيوم، 100 ملي مولار أسيتات المغنيسيوم (الأس الهيدروجيني 7.9 عند 25 درجة مئوية). B0220: 2.5 ملي مولار CoCl₂

أداء

الاختبار: الكمية المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 200 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 200 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 82.6 كيلو دالتون

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تحمل جين ناقل الطرفية المستنسخ من غدة التوتة للعجل مع علامة اندماج طرفية N.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية البوليميراز اللازمة لتحويل 1 نانومول من dTTPs إلى مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
مياه من النوع الأول: غير متوفر
مخزن مؤقت أخضر 10X (B0120): 1X
2.5 ملي مولار من كلوريد الكوبالت (B0220): 250 ميكرومولار
10 بمول DNA Termini (10-100 نانوغرام): 1-10 نانوغرام/ميليلتر
مزيج dNTP: 200 ميكرومول
TdT (P7070L): 0.4 وحدة/ميكرولتر
الحجم الكلي = 50 ميكرولتر

- حضّر مزيج التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر: المكونات التركيز النهائي الحجم ماء النوع الأول N/AX ميكرولتر 10X محلول أخضر (B0120) 1X 5 ميكرولتر 2.5 ملي مولار CoCl2 (B0220) 250 ميكرومولار 5 ميكرولتر 10 بيكومول نهايات الحمض النووي (10-100 نانوغرام) 1-10 نانوغرام/ميكرولتر X ميكرولتر مزيج dNTP 200 ميكرومولار X ميكرولتر TdT (P7070L) 0.4 وحدة/ميكرولتر 1 ميكرولتر الحجم الإجمالي = 50 ميكرولتر
- حضّنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- قم بتعطيل TdT وأوقف التفاعل عن طريق التسخين إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

تعليمات الاستخدام

إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) إلى النهايات 3′ للحمض النووي (DNA) دون استخدام قالب

ملاحظات: يزيد أيون الكوبالت (Co²⁺) من كفاءة دمج النيوكليوتيدات في البيريميدينات عند النهايات غير المتداخلة والنهايات المتراجعة 3'. مع ذلك، فإن إضافة النيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) إلى النهايات المتدلية 3' أكثر كفاءة من إضافتها إلى النهايات المتراجعة 3' أو النهايات غير المتداخلة. يتطلب إنزيم ناقل النيوكليوتيدات (TdT) وجود مجموعة هيدروكسيل حرة 3' لإجراء إضافة نيوكليوتيد غير موجهة.

بكفاءة محدودة، سيقوم إنزيم TdT بدمج الريبونوكليوتيدات والبيوتين والديوكسينوكليوتيدات في وجود Co 2+.

ضبط الجودة

يُقاس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1X، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي Oligo dT 20 mer، ومحلول تفاعل 1X، و0.25 ملي مولار من CoCl₂ 3H-dTTP، و100 ميكرومولار من dTTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (3).

يتم تحديد تركيز البروتين (OD 280) عن طريق امتصاص OD 280.

يُقيّم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعًا بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يُحدد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر، يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويُحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يتم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصل سلسلتيه وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات التي تتوافق مع موقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

التطبيقات

- وسم النهايات 3' بالنيوكليوتيدات المعدلة
- إضافة ذيل متجانس إلى نهايات الحمض النووي 3'-OH
- وسم النهايات غير الحادة لكسور الحمض النووي المزدوج (اختبار TUNEL)

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. دينغ، جي آر وو، آر. (1983) ميث. إنزيمول.، 100:96-116. 2. رويتشودري، آر. وآخرون. (1976) نيوك. أسيدز ريس.، 3،101-116. 3. سامبروك، جيه. وآخرون. (1989) مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور، الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر، (الطبعة الثانية)، 5.40-5.43.