كياجين، P7080L، بوليميراز الحمض النووي T4 (خارجي) (2000 وحدة)

2000 وحدة من بوليميراز الحمض النووي T4 (3000 وحدة/مل) ومحلول أزرق بتركيز 10x. درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

سمات

- يُظهر نشاط بوليميراز، والذي يحفز تخليق الحمض النووي من الطرف 5' إلى الطرف 3'
- يُظهر نشاطًا قويًا للإكسونوكلياز 3′→5′، وهو ما يُعرف بوظيفة التدقيق اللغوي.
- يفتقر إلى وظائف الإكسونوكلياز 5′→3′ أو وظائف إزاحة السلسلة

تفاصيل المنتج

يحفز إنزيم بوليميراز الحمض النووي T4 امتداد قالب الحمض النووي المُهيأ في الاتجاه 5′→3′. ويُظهر هذا الإنزيم نشاطًا قويًا لإنزيم إكسونوكلياز في الاتجاه 3′→5′، بينما يفتقر إلى أي وظائف لإنزيم إكسونوكلياز في الاتجاه 5′→3′ أو وظائف إزاحة السلسلة.

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية المؤتلفة التي تحمل جين بوليميراز الحمض النووي T4.

يُزوَّد الإنزيم في محلول يحتوي على 100 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم، و1 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول، و0.1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك، و50% جلسرين، عند درجة حموضة 6.5 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية. كما يُزوَّد بمحلول منظم أزرق 10X (B0110) يحتوي على: 500 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و100 ملي مولار من تريس-هيدروكلوريد، و100 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم، و10 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول، عند درجة حموضة 7.9 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

أداء

الفحص: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 5555 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونيوكلياز أحادي السلسلة: وظيفي
إنزيم إكسونيوكلياز مزدوج السلسلة: وظيفي
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 30 وحدة؛ لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 30 وحدة؛ أقل من 10 نسخ

مبدأ

يمتلك إنزيم بوليميراز الحمض النووي T4 نشاطين إنزيميين: نشاط البوليميراز، الذي يحفز تخليق الحمض النووي من الطرف 5' إلى الطرف 3'، ونشاط الإكسونوكلياز 3'→5'، وهو ما يُعرف بوظيفة التدقيق، التي تُمكّنه من التعرف على إدخال نيوكليوتيد غير مناسب ثم إزالته من الحمض النووي. على عكس بوليميراز الحمض النووي I في بكتيريا الإشريكية القولونية، يفتقر هذا الإنزيم إلى نشاط الإكسونوكلياز 5'→3'. يستخدم بوليميراز الحمض النووي T4 دائمًا شريطًا مفردًا موجودًا مسبقًا من الحمض النووي كقالب، ويتطلب بادئًا لتخليق شريط جديد مكمل.

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام بوليميراز الحمض النووي T4 في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول التفاعل 1X، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، ومحلول أزرق 1X، و3H-dTTP، و100 ميكرومول من dNTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

تم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

تم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة حزمة البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- صنع نهايات غير حادة للأسقف المتدلية بطول 5 أقدام أو 3 أقدام
- استنساخ فرعي لحذف سلسلة مفردة
- تخليق السلسلة الثانية في الطفرات الموجهة للموقع
- وسم المجسات باستخدام توليف الاستبدال

يتوفر إنزيم بوليميراز الحمض النووي T4 للتطبيقات التالية: