كياجين، P7140-LC-L، مانتا 1.0 بوليميراز الحمض النووي (تركيز منخفض)

100,000 وحدة (عبوة تقييم) من إنزيم بوليميراز الحمض النووي Manta 1.0 (2.5 مل عند 40,000 وحدة/مل) و10x PCR Buffer II (5 × 1.5 مل)

سمات

- بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة (Bst)
- نشاط قوي لإزاحة الخيوط
- لا يوجد نشاط إكسونوكلياز 5'→3' ولا نشاط إكسونوكلياز 3'→5'

تفاصيل المنتج

إنزيم بلمرة الحمض النووي مانتا 1.0 هو إنزيم بلمرة حمض نووي مقاوم للحرارة من بكتيريا العصوية (Bst) يتميز بقدرة عالية على إزاحة السلسلة. ويفتقر هذا الإنزيم إلى كلٍ من نشاطي النيوكلياز في تصحيح الأخطاء (3ʹ→ 5ʹ) وترجمة الشقوق (5ʹ→ 3ʹ). وقد تم توصيف هذا البروتين لأول مرة وحلّ بنيته البلورية بواسطة لورينا بيز (1).

مُزوَّدٌ في: 10 ملي مولار من Tris-HCl، و50 ملي مولار من KCl، و1.0 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، وأقل من 0.1% من Triton X-100، و50% من الجلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية. مُزوَّدٌ بـ: محلول PCR المُخفَّف 10X II (رقم المنتج B7140) يحتوي على 200 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من (NH₄)₂SO₄، و100 ملي مولار من KCl، و20 ملي مولار من MgSO₄، و1.0% من Triton X-100؛ درجة الحموضة 8.8 عند 25 درجة مئوية.

اسأل عن تركيبات الجلسرين المنخفضة.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 4000 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 4000 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 4000 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 4000 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

خصائص البوليميراز

مبدأ

مصدر البروتين الإنزيمي المؤتلف: يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين بوليميراز الحمض النووي Manta 1.0 (exo-).

تعريف الوحدة: يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية البوليميراز المطلوبة لتحويل 10 نانومول من dNTPs إلى مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية.

الوزن الجزيئي: 66215 دالتون

إجراء

تعليمات الاستخدام:

يُظهر إنزيم Manta 1.0 DNA Polymerase نشاطًا قويًا في إزاحة السلسلة ويمكن استخدامه في طرق تضخيم الأحماض النووية المختلفة، مثل التضخيم متساوي الحرارة، والتضخيم الكامل للجينوم، والتضخيم متعدد الإزاحة.

ظروف التفاعل

تتراوح درجة حرارة التفاعل المثلى بين 60-65 درجة مئوية.

يحتوي محلول التفاعل 10X على 2 ملي مول من كبريتات المغنيسيوم بتركيز 1X. لا يحتوي المحلول على أي نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs).

لتحسين النتائج، أضف MgSO4 حتى 10 ملي مولار، وبوليميراز مانتا 1.0 حتى 1.6 وحدة/ميكرولتر.

تحليل مراقبة الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات من دفعة الإنزيم في محلول التفاعل 1X، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، ومحلول تفاعل البوليميراز المتسلسل 1X، و3H-dTTP، و100 ميكرومول من dNTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (2).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويتم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

يتم تقييم تلوث الحمض النووي الريبوزي 16S لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لبكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع الحمض النووي الريبوزي 16S.

التطبيقات

- التضخيم متساوي الحرارة
- تضخيم الجينوم الكامل (WGA)
- تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA)

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

المراجع: 1. كيفر وآخرون، ستراكشر، 15 يناير 1997، 5، 95-108. 2. سامبروك، ج. وآخرون (1989)، مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور، الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر، (الطبعة الثانية)، 5.40-5.43.