كياجين، P7180L، بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (50000 وحدة)

50,000 وحدة/مل من بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ومحلول منظم لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بتركيز 10X

سمات

- بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي
- خصوصية عالية لمُحفِّز T7
- يحفز عملية تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) من النيوكليوتيدات الريبوزية (rNTPs) المعتمدة على أيونات المغنيسيوم (Mg2+).

تفاصيل المنتج

يُوفر إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 عملية تخليق الحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي (DNA) باتجاه 5'→ 3'. يتطلب هذا الإنزيم مُحفز الحمض النووي الريبي T7 ثنائي السلاسل لبدء عملية النسخ، ولكنه قادر على نسخ الحمض النووي الريبي من قوالب الحمض النووي أحادية وثنائية السلاسل. يُوفر الإنزيم في محلول يحتوي على 50 ملي مولار من Tris-HCl، و100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و1 ملي مولار من DTT، و0.1 ملي مولار من EDTA، و50% من الجلسرين، وأقل من 0.1% من Triton X-100؛ عند درجة حموضة 7.9 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول 10X T7 RNA Polymerase Buffer (B7180) على 400 مليمولار Tris-HCl، و60 مليمولار MgCl2، و100 مليمولار DTT، و20 مليمولار سبيرميدين؛ درجة الحموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 500 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 500 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 500 وحدة
تلوث الحمض النووي الريبوزي (RNAse): 500 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 98855 دالتون

مبدأ

يُنتَج البروتين الإنزيمي المُعاد تركيبه بواسطة سلالة مُعاد تركيبها من بكتيريا الإشريكية القولونية تحمل جين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي تُدمج 1 نانومول من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في مادة قابلة للترسيب الحمضي خلال ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
محلول التفاعل 10X (B7180): 1X
rNTP: 500 ميكرومول لكل منها
قالب الحمض النووي: 0.2-1 ميكروغرام
بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 (P7180L): 100 وحدة

- قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر:

تعليمات الاستخدام

تخليق الحمض النووي الريبي غير الموسوم

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

المراجع: 1. تشامبرلين، م. وآخرون (1973) مجلة الكيمياء البيولوجية، 248، 2235-2244، 2245-2250. 2. تشامبرلين، م. وآخرون (1982) في كتاب الإنزيمات، الطبعة الثالثة، تحرير ب. د. بوير (دار النشر الأكاديمية، نيويورك)، 15، 87-108. 3. سامبروك، ج. وآخرون (1989) مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور، الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر، (الطبعة الثانية)، 5.40-5.43.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تخزين بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 المحتوي على 50% جلسرين، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على بلازميد DNA يحتوي على محفز T7، ومحلول منظم لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7 بتركيز 1X، و3H-ATP، و400 ميكرومول من كل من ATP وGTP وCTP وUTP. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، المجلد 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

يتم تقييم التلوث غير المحدد بالـ RNAse باستخدام مجموعة RNAse Alert (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- تخليق الحمض النووي الريبي من قالب الحمض النووي
- تحضير مجسات الحمض النووي الريبي
- العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: