كياجين، P7260L، بوليميراز الحمض النووي T7 (3500 وحدة)

3500 وحدة من بوليميراز الحمض النووي T7 (0.35 مل عند 10000 وحدة/مل) ومحلول منظم لبوليميراز الحمض النووي T7 بتركيز 10X (1 × 1.5 مل)

سمات

- نشاط إكسونوكلياز قوي من 3′ إلى 5′ يعمل على كل من الحمض النووي أحادي السلسلة وثنائي السلسلة
بوليميراز الحمض النووي المحب للحرارة المعتدلة، عالي الكفاءة، ومتضاعف.

تفاصيل المنتج

إنزيم بوليميراز الحمض النووي T7 هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي عالي الكفاءة، محب للحرارة المعتدلة، من عاثية T7، وهو المسؤول عن التضاعف السريع والدقيق لجينوم الفيروس خلال دورة العدوى. يتكون هذا الإنزيم من وحدتين فرعيتين: نطاق البوليميراز (الجين 5 من عاثية T7) وعامل الكفاءة (جين trxA من بكتيريا الإشريكية القولونية، وهو الثيوريدوكسين) (1، 2). يتميز هذا الإنزيم بنشاط نوكلياز خارجي قوي (3′→5′) يعمل على كل من الحمض النووي أحادي وثنائي السلسلة، ويبدو أنه مسؤول عن دقة هذا الإنزيم العالية ويمنع تخليق الحمض النووي عن طريق إزاحة السلسلة (3، 4، 5).

إنزيم بوليميراز الحمض النووي T7 هو إنزيم بوليميراز عالي الكفاءة يتميز بمعدل تخليق وتضاعف عالي للغاية. يُزوَّد الإنزيم في محلول يحتوي على 50 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم، و0.1 ملي مولار من الإيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك، و1.0 ملي مولار من ثنائي ثيوثريتول، و50% من الجلسرين؛ عند درجة حموضة 7.0 ودرجة حرارة 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول منظم بوليميراز الحمض النووي T7 10X (B7260) على 400 ملي مولار من Tris-HCl، و200 ملي مولار من MgCl2، و500 ملي مولار من NaCl؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >99%
النشاط النوعي: 13333 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونيوكلياز أحادي السلسلة: وظيفي
إنزيم إكسونيوكلياز مزدوج السلسلة: وظيفي
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 100 وحدة، بدون تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 100 وحدة، أقل من 10 نسخ

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 92140 دالتون

مبدأ

يتم إنتاج بروتين الإنزيم المؤتلف بواسطة سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين العاثية T7 5.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية البوليميراز اللازمة لتحويل 10 نانومول من إجمالي dNTPs إلى مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

إجراء

المكونات: التركيز النهائي
ماء خالٍ من النيوكلياز: غير متوفر
مُعالج مسبقًا/قالب: 20 نانومول من المركب
محلول منظم لبوليميراز الحمض النووي بتركيز 10X (B7260): 1X
محلول dNTP بتركيز 25 ملي مولار: 300 ميكرومولار
بوليميراز الحمض النووي T7 (P7260L): 500 وحدة/مل
الحجم الكلي = 40 ميكرولتر

- في وعاء تفاعل معقم، اجمع المكونات التالية:

تعليمات الاستخدام

يمكن تطبيق سير العمل التالي إما على تخليق السلسلة الثانية بعد تخليق السلسلة الأولى من قالب الحمض النووي الريبي، أو على تجربة الطفرات الموجهة للموقع حيث يتم تمديد البادئ الطفري بحيث يتم نسخ سلسلة القالب بأكملها.

2. حضّن لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. حضّن لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لإيقاف التفاعل.

ملاحظة: هذا الإنزيم غير مناسب لتسلسل الحمض النووي.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط الوحدة باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول التفاعل 1X، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، ومحلول توصيف وحدة بوليميراز الحمض النووي T7 1X (20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار KCl، 6 ملي مولار MgCl2، 0.1 ملي مولار EDTA، 5 ملي مولار β-ميركابتوإيثانول)، و3H-dTTP، و150 ميكرومولار dNTPs. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، المجلد 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- نسخ فترات طويلة
- التلاعب بالحمض النووي
- الطفرات الموجهة للموقع
- تركيب السلسلة الثانية
- تفاعل ملء الفجوة (بدون إزاحة للخيوط)
- اختبار ISEL: الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق الوسم الموضعي لكسور الحمض النووي

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع

1. جريبو، P.، وآخرون. (1971) ج. بيول. الكيمياء. 246:6867. 2. مودريش، P.، وآخرون. (1975) ج. بيول. الكيمياء. 250:5515. 3. أدلر، S.، وآخرون. (1979) ج. بيول. الكيمياء. 254:11605. 4. هوري، ك، وآخرون. (1979) ج. بيول. الكيمياء. 254:11598. 5. ليخنر، ر.ل. وآخرون. (1983) ج. بيول. الكيمياء. 258:11185.