كياجين، P7460L، بوليميراز بولي (أ) (1000 وحدة)

1000 وحدة من بوليميراز بولي (أ) (5000 وحدة/مل) ومحلول تفاعل بوليميراز بولي (أ) 10x.

سمات

- يحفز إضافة AMP من ATP إلى مجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي الريبي (RNA)

تفاصيل المنتج

يقوم بوليميراز بولي (أ) بربط ATP (المحفز من AMP) بالهيدروكسيل 3' من RNA، وهو أمر مفيد لصنع RNA ذي ذيل بولي (أ).

يتم توفير الإنزيم في 25 ملي مولار Tris-HCl، 500 ملي مولار NaCl، 1 ملي مولار MgCl2، 0.1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA و 50% جلسرين؛ درجة الحموضة 8.0 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول التفاعل لبوليميراز بولي (أ) بتركيز 10x على 500 ملي مولار من Tris-HCl، و2.5 مولار من NaCl، و100 ملي مولار من MgCl2، مع درجة حموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: >95%
النشاط النوعي: >20,000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 200 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 200 وحدة
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 100 وحدة
تلوث بالريبونوكلياز: 200 وحدة

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 53870 دالتون

يحفز إنزيم بوليميراز بولي (أ) إضافة AMP من ATP إلى مجموعة الهيدروكسيل 3' في الحمض النووي الريبي. يتطلب هذا التفاعل أيونات المغنيسيوم (Mg2+) وهو مستقل عن القالب.

مبدأ

يتم إنتاج البروتين بواسطة سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية التي تعبر عن جين بوليميراز بولي (أ) من بلازميد.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 1 نانومول من ATP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.

إجراء

- 1-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي النقي في 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز
- 2 ميكرولتر من محلول تفاعل بوليميراز بولي (أ) بتركيز 10x (B7460)
- 2 ميكرولتر 10 ملي مولار ATP (N2070-10)
- 1 ميكرولتر من بوليميراز بولي (أ) (P7460L)

تعليمات الاستخدام

1. قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر بالترتيب المذكور:

2. قم بحضانة خليط التفاعل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

3. أوقف التفاعل بإضافة EDTA (بتركيز نهائي 10 ملي مولار) أو انتقل إلى خطوة التنظيف.

ضبط الجودة

تم قياس النشاط النوعي باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول تفاعل 1x (50 ملي مولار Tris-HCl، 250 ملي مولار NaCl، 10 ملي مولار MgCl₂، درجة حموضة 7.9 عند 25 درجة مئوية)، وأضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على أوليغونوكليوتيد RNA مكون من 15 قاعدة، ومحلول تفاعل 1x، و1 ملي مولار ATP، و2.5 ملي مولار MnCl₂، و3H-ATP. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

يتم تقييم التلوث غير المحدد بالـ RNAse باستخدام مجموعة RNAse Alert (Integrated DNA Technologies)، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

التطبيقات

- صنع الحمض النووي الريبي ذي الذيل متعدد الأدينين
- وسم الحمض النووي الريبي عند الطرف 3'
- العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال

- Cao, GJ and Sarkar, N. (1992) PNAS, 89, 10380-10384.
- Sambrook, J. and Russell, DW (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., v3, A8.25-A8.26.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع