كياجين، P7590L، بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن من فينيكس (500 وحدة)

500 وحدة من بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البداية الساخنة من Phoenix (0.10 مل عند 5000 وحدة/مل)، ومحلول تفاعل Taq ذو البداية الساخنة من Phoenix 5x (4 × 1.5 مل)، ومحلول تفاعل GC ذو البداية الساخنة من Phoenix 5x (2 × 1.5 مل).

سمات

- بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة 5ʹ→3ʹ مع بدء ساخن بوساطة الأجسام المضادة
- زيادة في الخصوصية والحساسية والإنتاجية في تفاعلات PCR
- يفتقر إلى وظيفة التدقيق اللغوي 3ʹ→5ʹ ولكنه يحتفظ بنشاط الإكسونوكلياز 5ʹ→3ʹ
- ثبات لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة لسهولة الإعداد وسير العمل الآلي
- تحمل نطاقات واسعة من أيونات المغنيسيوم (Mg2+) ودرجات حرارة التلدين

تفاصيل المنتج

يوفر إنزيم Phoenix™ Hot Start Taq DNA Polymerase بداية ساخنة قائمة على الأجسام المضادة لأداء قوي في تفاعل البوليميراز المتسلسل مع استقرار استثنائي في درجة حرارة الغرفة قبل بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يتم توفيره في: 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار EDTA، مثبت و 50٪ جلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

المرفقات: 5X Phoenix Hot Start Taq Reaction Buffer (B7590) و 5X Phoenix Hot Start Taq GC Reaction Buffer (B7591)

توفر شركة QIAGEN OEM تصنيعًا بالجملة لإنزيم Phoenix Hot Start Taq DNA Polymerase في تركيبات مخصصة، بما في ذلك التركيبات منخفضة الجلسرين والخالية من الجلسرين.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 50 وحدة
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 50 وحدة
تثبيط Taq: غير متوفر
الفحص الوظيفي: غير متوفر

- زيادة خصوصية التضخيم مقارنةً ببوليميراز الحمض النووي Taq العادي
- زيادة إنتاجية التضخيم ومعدل النجاح الإجمالي
- إعادة تنشيط سريعة ووقت دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل أقصر باستخدام طريقة الأجسام المضادة
- تضخيم عالي الحساسية باستخدام 300 بيكوغرام من الحمض النووي الجينومي البشري
- إمكانية تعدد الإرسال مع الحد الأدنى من التحسين
- معدلات نجاح عالية مع الأهداف الغنية بالـ GC

إنزيم فينيكس هوت ستارت تاك دي إن إيه بوليميراز هو إنزيم تاك دي إن إيه بوليميراز مُعاد التركيب، مقاوم للحرارة، مُرتبط بجسم مضاد مُعادل مقاوم للحرارة، يعمل على تثبيط نشاط البوليميراز 5ʹ→3ʹ قبل خطوة تمسخ الحمض النووي الأولية في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (1، 2). تُعزز هذه الخاصية، التي تعتمد على الجسم المضاد، لبدء التفاعل الساخن، مما يُحسّن من الخصوصية والحساسية والإنتاجية الإجمالية لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عن طريق تقليل التضخيم غير النوعي وتكوين ثنائيات البادئات قبل دورات تفاعل البلمرة المتسلسل، كما يُتيح سهولة تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة. عندما تصل درجة حرارة خليط تفاعل البلمرة المتسلسل إلى 94 درجة مئوية أو أكثر خلال خطوة تمسخ الحمض النووي الأولية في دورات تفاعل البلمرة المتسلسل، يستعيد إنزيم تاك دي إن إيه بوليميراز نشاطه بالكامل. يتميز إنزيم فينيكس هوت ستارت تاك دي إن إيه بوليميراز، مثل إنزيم تاك دي إن إيه بوليميراز القياسي، بنشاط إكسونوكلياز 5ʹ→3ʹ، ولكنه يفتقر إلى أي نشاط إكسونوكلياز 3ʹ→5ʹ قابل للكشف.

خصائص البوليميراز

درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

مبدأ

مصدر بروتين الإنزيم المؤتلف: سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين Taq DNA polymerase من الكائن المحب للحرارة Thermus aquaticus YT-1 المرتبط بجسم مضاد أحادي النسيلة مشتق من مزرعة خلايا الفئران.

تعريف الوحدة: يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية.

الوزن الجزيئي: 94 كيلو دالتون

درجة حرارة التمديد المثلى: 66-72 درجة مئوية

معدل التمديد: 60 ثانية لكل كيلوبايت عند درجة حرارة 72 درجة مئوية

التدقيق اللغوي (3-5 دقائق): لا

ترجمة الاسم المستعار (5'-3' exo): نعم

إزاحة الخيط: لا

يمتد من شق: نعم

إجراء

المكون: الحجم (ميكرولتر)
الماء المعقم: متغير
5x محلول تفاعل Phoenix Hot Start Taq أو 5x محلول تفاعل Phoenix Hot Start Taq GC: 10
مزيج dNTP بتركيز 10 ملي مولار: 1
التمهيدي 1: متغير
التمهيدي 2: متغير
قالب الحمض النووي: متغير
بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البداية الساخنة من فينيكس: 0.2

الخطوة: درجة الحرارة
درجة حرارة التمسخ الأولية*: 94 درجة مئوية
التمديد والتسخين والتسخين: 94 درجة مئوية، يختلف 72 درجة مئوية
التمديد النهائي: 72 درجة مئوية 4 درجات مئوية

التعقيد: المصدر (مثال)
منخفض: بلازميد، فيروس، BAC
مرتفع: الحمض النووي الجينومي

ينبغي اتخاذ الاحتياطات العامة عند تحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بما في ذلك خطوات لتجنب التلوث المتبادل وضمان استخدام الماصة برفق، والخلط الجيد، والطرد المركزي لفترة وجيزة بعد إضافة جميع المكونات إلى التفاعل. يمكن استخدام الإجراء التالي كدليل إرشادي. قد يلزم تحسين التفاعلات بشكل فردي حسب النتيجة المرجوة.

تُقدّم الجداول أدناه معلوماتٍ لتفاعلات حجمها 50 ميكرولتر وظروف التدوير النموذجية. يمكن تعديل حجم التفاعل الكلي حسب الحاجة. قد يلزم تحسين ظروف التدوير، وذلك تبعًا للمنتج المُضخّم المطلوب.

* مطلوب لتفكيك القالب وتنشيط بوليميراز Phoenix Hot Start Taq.

ملاحظات الاستخدام: ١. يُنصح باستخدام محلول Phoenix Hot Start Taq Buffer بتركيز ٥x كمحلول افتراضي. بالنسبة للقوالب الغنية بالـ GC والقوالب الصعبة، استخدم محلول Phoenix Hot Start Taq GC Buffer بتركيز ٥x. ٢. يُوصى بتركيز نهائي قدره ٠.٢ ميكرومول لكل بادئ، ولكن يمكن تغييره ضمن نطاق ٠.٢-١ ميكرومول. ٣. يوضح الجدول التالي كميات القوالب الموصى بها.

٤. عادةً ما تكفي وحدة واحدة من الإنزيم لتضخيم معظم الأهداف، ولكن قد يلزم المزيد (حتى ٢.٥ وحدة) في تفاعل البوليميراز المتعدد أو لزيادة إنتاجية الأهداف الصعبة أو الطويلة. ٥. تم تركيب كل من محلول Phoenix Hot Start Taq Buffer بتركيز ٥x ومحلول GC buffer بحيث يوفران ٢ ملي مول من أيونات المغنيسيوم (Mg²⁺) في التفاعل النهائي (أي عند تخفيفهما إلى تركيز ١x). في الحالات التي تتطلب تحسينًا إضافيًا لتركيز أيونات المغنيسيوم، اضبط التركيز النهائي لأيونات المغنيسيوم بخطوات مقدارها ٠.٢ ملي مول.

تحليل مراقبة الجودة

تم تقييم فعالية إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq من نوع Phoenix Hot Start من خلال قدرته على تضخيم أهداف الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في محلولي التفاعل B7590 وB7591 بعد حضانة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد التنشيط الحراري وتضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل، أظهرت العينات نواتج تضخيم مرئية على شكل حزمة واحدة، كما تم تحديده بواسطة الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز.

يُقاس تثبيط إنزيم Taq من خلال النشاط المتبقي لإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq المُفعّل بالحرارة Phoenix Hot Start في غياب خطوة التنشيط الحراري عند درجة حرارة ≥ 94 درجة مئوية. تم تحضين إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq المُفعّل بالحرارة Phoenix Hot Start وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq (إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq بدون أجسام مضادة لإنزيم Taq) في وجود حمض نووي من غدة التوتة العجلية، و50 ميكرومول من 3H-dTTP، و100 ميكرومول من dNTPs، ومحلول التفاعل B7590 أو B7591 بتركيز 1X. بعد حضانة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تم تحليل العينات لحساب إجمالي عدد جزيئات 3H-dTTP المدمجة باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم، ويتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

التطبيقات

- تضخيم الحمض النووي بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الروتيني حتى 5 كيلوبايت
- تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الإنتاجية
- تمديد البرايمر
- تفاعل البوليميراز المتعدد وتفاعل البوليميراز العكسي
- تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي القائم على المجسات أو الأصباغ وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

المراجع 1. تشو، كيو، وآخرون (1992) أبحاث الأحماض النووية 20: 1717. 2. شاركي، دي، وآخرون (1994) التكنولوجيا الحيوية الطبيعية 12: 506.