Qiagen، P7600L، إنزيم النسخ العكسي EnzScript (10000 وحدة)

10000 وحدة من إنزيم النسخ العكسي EnzScript (0.05 مل عند 200000 وحدة/مل) و5x M-MLV Reverse Transcriptase RNase H Minus Buffer (1 × 1.5 مل) و100 ملي مولار DTT (1 × 1.5 مل).

سمات

- فيروس M-MLV ناقص إنزيم RNase H مع زيادة في الثبات الحراري
- مناسب لاستنساخ الحمض النووي التكميلي (cDNA) و RT-PCR
- يُوصى به لبناء المكتبات لدراسات النسخ الجيني بتقنية RNA-Seq
- متوافق مع البادئات السداسية العشوائية، وأوليجو (dT)، والبادئات الخاصة بالجينات

تفاصيل المنتج

إن إنزيم النسخ العكسي EnzScript هو إنزيم نسخ عكسي لفيروس لوكيميا الفئران مولوني (M-MLV) يحمل طفرات نقطية في نطاق RNase H، مما يُلغي نشاط RNase H القابل للكشف. يُمكن استخدام EnzScript لإنتاج الحمض النووي التكميلي (cDNA) أحادي السلسلة من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) متعدد الأدينين (poly(A)) أو الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) لاستخدامه في تطبيقات لاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، واستنساخ الحمض النووي التكميلي، أو بناء مكتبات لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq). تُعزز الطفرات النقطية في نطاق RNase H الثبات الحراري للإنزيم، وتُسهم في إنتاج كميات أكبر من الحمض النووي التكميلي (cDNA) من النسخ الكاملة مقارنةً بإنزيم النسخ العكسي M-MLV من النوع البري.

يتم تعريف وحدة واحدة من EnzScript Reverse Transcriptase على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لدمج 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام poly r(A)/oligo(dT) كركيزة.

يتم توفير إنزيم النسخ العكسي EnzScript في 20 ملي مولار Tris-HCl، 100 ملي مولار NaCl، 0.1 ملي مولار EDTA، 1 ملي مولار DTT، <0.01% مثبت NP-40 و50% جلسرين؛ درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.

يتم تزويد EnzScript Reverse Transcriptase مع 5X M-MLV Reverse Transcriptase RNase H– Reaction Buffer (رقم المنتج B7601) و 100mM DTT (رقم المنتج B9060).

أداء

الاختبار: المواصفات
النقاء: >95%
النشاط النوعي: 180,000 وحدة/ملغ
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 2000 وحدة <5% مُحرر
إنزيم إكسونوكلياز ثنائي السلسلة: 2000 وحدة <1% مُحرر
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 2000 وحدة = لا يوجد تحويل
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 2000 وحدة <10 نسخ
تلوث بإنزيم RNase: 2000 وحدة؛ لا يوجد إنزيم RNase غير محدد قابل للكشف
اختبار RT-PCR الوظيفي: تخليق نسخة cDNA بحجم 9.4 كيلوبايت

- درجة حرارة التمديد المثلى: 42 درجة مئوية
- طول النص: حتى 9.4 كيلوبايت

خصائص البوليميراز

مبدأ

إنزيم النسخ العكسي (RT)، المعروف أيضاً باسم بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي، هو إنزيم بوليميراز الحمض النووي الذي ينسخ الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة إلى حمض نووي. تستخدم الفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد ب، إنزيمات النسخ العكسي لتضاعف جينوماتها.

تُستخدم إنزيمات النسخ العكسي في البيولوجيا الجزيئية للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) ومعالجتها من خلال التضخيم. تقوم هذه الإنزيمات ببلمرة سلسلة من الحمض النووي (cDNA) تُكمل قالب الحمض النووي الريبوزي الأصلي. بعد ذلك، يمكن تضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) بشكل أكبر باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحليل النسخ والتعبير الجيني.

يمتلك إنزيم النسخ العكسي الفيروسي الأصلي ثلاث وظائف كيميائية حيوية متسلسلة: نشاط بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي، ونشاط ريبونوكلياز H (RNase H)، ونشاط بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي. تُمكّن هذه الوظائف مجتمعةً الإنزيم من تحويل الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة إلى الحمض النووي التكميلي ثنائي السلسلة.

يُؤدي نشاط إنزيم RNase H إلى تحلل شريط الحمض النووي الريبوزي (RNA) في هجين الحمض النووي (DNA/RNA)، مما يُحرر شريط الحمض النووي (DNA) المُصنّع حديثًا لاستخدامه كقالب في تخليق الشريط الثاني من الحمض النووي (DNA). يُعتبر نشاط إنزيم RNase H غير مُفيد لتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) الطويل، نظرًا لقدرة الإنزيم على تحلل قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) قبل اكتمال عملية النسخ العكسي الكاملة.

لا يمتلك إنزيم النسخ العكسي EnzScript أي نشاط ملحوظ لإنزيم RNase H، ويتميز بثبات حراري عالٍ. يُعد هذا الإنزيم مناسبًا لإنتاج الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) متعدد الأدينين (poly(A)) أو الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) لاستخدامه في تطبيقات لاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، واستنساخ الحمض النووي التكميلي، أو بناء مكتبات الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq).

إجراء

تتوفر تعليمات استخدام إنزيم النسخ العكسي EnzScript في بروتوكول المجموعة المقابل في الموارد أدناه.

ضبط الجودة

تم قياس نشاط وحدة إنزيم النسخ العكسي EnzScript باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. تم تحضير تخفيفات الإنزيم في محلول منظم M-MuLV RT RNAse H- بتركيز 1X، وأُضيفت إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على 20 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبوزي متعدد الأدينين (poly r(A))، وحمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) قليل النوكليوتيدات (oligo (dT))، ومحلول منظم RT بتركيز 1X، و3H-dTTP، و250 ميكرومول من dTTP. حُضنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية، ثم وُضعت على الجليد، وحُللت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، الإصدار 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

تم تحديد تركيز البروتين لإنزيم النسخ العكسي EnzScript (OD 280) عن طريق قياس الامتصاص عند OD 280.

تم تقييم النقاء الفيزيائي لإنزيم النسخ العكسي EnzScript باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. وقد تم تقييم النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية للأشرطة الملوثة في العينة المركزة بكتلة شريط البروتين المطلوب في العينة المخففة.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في إنزيم النسخ العكسي EnzScript في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في إنزيم النسخ العكسي EnzScript في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في إنزيم النسخ العكسي EnzScript في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم وتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

تم تقييم تلوث E. coli لـ EnzScript Reverse Transcriptase باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي تم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث لـ E. coli باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

تم تقييم التلوث غير المحدد لـ RNase في EnzScript Reverse Transcriptase باستخدام مجموعة الكشف عن النيوكلياز وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

تم تحديد وظيفة النسخ العكسي لإنزيم EnzScript من خلال قدرته على توليد نسخة cDNA بحجم 9.4 كيلوبايت. بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي على مرحلتين، تم تصوير ناتج التضخيم بحجم 9.4 كيلوبايت باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز.

التطبيقات

- تضخيم RT-PCR
- استنساخ الحمض النووي التكميلي
- بناء مكتبة لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq)

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: