Qiagen، P7620L، TaqIT DNA بوليميريز (5000 U)

5000 وحدة من بوليميريز الحمض النووي TaqIT (50.000 وحدة/مل) و10x مخزن تفاعل TaqIT.

سمات

- مشتق من بوليميراز الحمض النووي Taq يفتقر إلى الإكسونوكلياز
- أكثر استقرارًا حراريًا ودقة من بوليميراز الحمض النووي Taq كامل الطول

تفاصيل المنتج

إن إنزيم TaqIT DNA Polymerase هو مشتق من إنزيم Taq DNA polymerase يفتقر إلى الإكسونوكلياز.

يتم توفير الإنزيم في 20 ملي مولار Tris-HCl، 222 ملي مولار (NH4)2SO4، 10 ملي مولار β-mercaptoethanol، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% Brij 58 و50% جلسرين؛ درجة الحموضة 8.6 عند 25 درجة مئوية.

يحتوي محلول التفاعل TaqIT 10x على 500 ملي مولار من Tris-HCl، و160 ملي مولار من (NH4)2SO4، و35 ملي مولار من MgCl2، و0.25% من Brij 58؛ درجة الحموضة 9.2 عند 25 درجة مئوية.

أداء

الاختبار: الوحدات المختبرة
النقاء: غير متوفر
النشاط المحدد: غير متوفر
إنزيم إكسونوكلياز أحادي السلسلة: 500
إنزيم إكسونوكلياز مزدوج السلسلة: 500
إنزيم نوكلياز مزدوج السلسلة: 500
تلوث الحمض النووي لبكتيريا الإشريكية القولونية: 500

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية
- الوزن الجزيئي: 62407 دالتون

مبدأ

إنزيم TaqIT DNA Polymerase هو مشتق من إنزيم Taq DNA Polymerase يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز. يفتقر هذا الإنزيم إلى أول 280 حمضًا أمينيًا من إنزيم Taq الأصلي، والتي تحتوي على نطاق الإكسونوكلياز 5ʹ→3ʹ. هذا الحذف يجعل إنزيم TaqIT أكثر استقرارًا حراريًا ودقةً من إنزيم Taq كامل الطول. ومثل إنزيم Taq، لا يمتلك إنزيم TaqIT DNA Polymerase نشاط إكسونوكلياز 3ʹ→5ʹ.

سلالة معاد تركيبها من الإشريكية القولونية تحمل جين TaqIT من الكائن المحب للحرارة Thermus aquaticus YT-1.

تُعرَّف الوحدة الواحدة بأنها كمية الإنزيم التي ستدمج 10 نانومول من dNTP في مادة غير قابلة للذوبان في الأحماض في 30 دقيقة عند 75 درجة مئوية.

إجراء

المكون: الحجم (ميكرولتر)
ماء خالٍ من النيوكلياز: x
محلول تفاعل TaqIT بتركيز 10x (B7620): 5
مزيج dNTP بتركيز 10 ملي مولار: 1
التمهيدي 1: x
التمهيدي 2: x
قالب الحمض النووي: x
TaqIT (P7620L): 0.1–0.5

الخطوة: درجة الحرارة
درجة حرارة التمسخ الأولية: 94 درجة مئوية
التمسخ: 94 درجة مئوية
التلدين: 50-65 درجة مئوية
التمديد: 72 درجة مئوية
التمديد النهائي: 72 درجة مئوية
4 درجة مئوية

تعليمات الاستخدام

قم بإعداد خليط التفاعل التالي بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر

ملاحظة: يمكن تعديل مستويات الصوت حسب الحاجة.

ظروف ركوب الدراجات

ملاحظة: قد يلزم تحسين ظروف التدوير اعتمادًا على المنتج المضخم المطلوب.

ضبط الجودة

تم قياس النشاط النوعي باستخدام طريقة التخفيف التسلسلي الثنائي. خُفِّف الإنزيم في محلول تخزين بوليميراز الحمض النووي TaqIT المحتوي على جلسرين مُخفَّض (5%)، وأُضيف إلى تفاعلات حجمها 50 ميكرولتر تحتوي على حمض نووي من غدة التوتة العجلية، و25 ملي مولار من TAPS (الأس الهيدروجيني 9.3)، و50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و1 ملي مولار من DTT، و3H-dTTP، و100 ميكرومولار من dNTPs. حُضِّنت التفاعلات لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية، ثم وُضِعت على الجليد، وحُلِّلت باستخدام طريقة سامبروك وراسل (الاستنساخ الجزيئي، المجلد 3، 2001، الصفحات A8.25-A8.26).

يتم تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.

يتم تقييم النقاء الفيزيائي باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE لمحاليل الإنزيم المركزة والمخففة، متبوعةً بالكشف باستخدام صبغة الفضة. ويُقاس النقاء بمقارنة الكتلة الإجمالية لحزم الملوثات في العينة المركزة بكتلة الحزمة المقابلة للبروتين المطلوب في العينة المخففة.

يتم تحديد الإكسونوكلياز أحادي السلسلة في تفاعل حجمه 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA أحادية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإكسونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على ركيزة DNA ثنائية السلسلة موسومة إشعاعيًا و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تحديد نشاط الإندونوكلياز ثنائي السلسلة في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي و10 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم تحضينه لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.

يتم تقييم التلوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام عينات مكررة بحجم 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم الذي يتم فصله وفحصه في اختبار TaqMan qPCR للكشف عن وجود الحمض النووي الجينومي الملوث ببكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات المقابلة لموقع 16S rRNA.

التطبيقات

- منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أطول من منتجات بوليميراز Taq القياسي
- تحديد النمط الجيني

- بارنز، دبليو إم. (1992). تحسين دقة بوليميراز Taq المحفز لتفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق حذف الطرف الأميني. جين 112:29.
- كارانتزيني، آي.، رويز، سي.، ليو، سي سي.، ليكاتا، في جيه (2003) مقارنة التمسخ الحراري لبوليميراز الحمض النووي من النوع 1 في بكتيريا Thermus aquaticus و Escherichia coli. مجلة الكيمياء الحيوية 374:785.

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل:

مراجع