Qiagen، P7640L، ZipScript One-Step RT-qPCR Kit (1000 تفاعل)

لـ 1000 تفاعل (عبوة تقييم) من 25x مزيج إنزيم ZipScript (1 × 0.80 مل) و2x محلول التفاعل ZipScript I (8 × 1.5 مل)

سمات

- محلول RT-qPCR عالي الحساسية والنوعية وقابل للتكرار
- تركيبة فعالة متعددة الخطوات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
- يتميز ZipScript بمزيج مُحسَّن من EnzScript RT و Phoenix Hot Start DNA Polymerase
- تم تركيب ZipScript WarmX باستخدام إنزيم النسخ العكسي القائم على الأبتامر
- يقلل برنامج ZipScript WarmX من النسخ العكسي غير المحدد أثناء إعداد التفاعل
- برنامج ZipScript WarmX سهل الاستخدام مع أنظمة التشغيل الآلي لضبط درجة حرارة الغرفة

تفاصيل المنتج

تُعدّ مجموعتا ZipScript One-Step RT-qPCR وZipScript WarmX One-Step RT-qPCR حلولًا عالية الحساسية وقابلة للتكرار لتقنية RT-qPCR، مُحسّنة خصيصًا لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR). تُمكّن تركيبة qPCR المتعددة عالية الكفاءة والمعتمدة على الحمض النووي الريبي (RNA) من الكشف عن نطاق واسع من العينات. تتميز ZipScript بمزيج من إنزيم النسخ العكسي الخالي من RNase H (إنزيم النسخ العكسي EnzScript) وإنزيم بوليميراز الحمض النووي سريع التنشيط (إنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq ذو البداية الساخنة Phoenix). ولتسهيل الاستخدام، يُمكن الكشف عن كميات ضئيلة تصل إلى 0.1 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي (RNA) في اختبار رباعي باستخدام صيغة التفاعل أحادية الخطوة. بالإضافة إلى الأداء الرائد في السوق لتقنية RT-qPCR، تضمن عمليات التصنيع العالمية من قِبل QIAGEN نتائج متسقة وقابلة للتكرار في مختبرك.

تتميز مجموعة ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR بتقنية بدء التشغيل الدافئ القائمة على الأبتامر، والتي تمنع النسخ العكسي أثناء تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة، مما يحسن من دقة وفعالية التحليل. يمكن تحضير التفاعلات في درجة حرارة الغرفة بثقة أكبر، خاصةً عند استخدام حلول آلية عالية الإنتاجية.

المرفقات: 2X ZipScript Reaction Buffer 1 (B7641L) استفسر عن الخيارات المجففة بالتجميد أو الجاهزة للتجميد.

أداء

- نطاق كشف واسع: حساسية عالية (<0.1 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي البشري الكلي) مقترنة بنطاق كشف واسع (>7 مراتب من حيث الحجم).
- تعدد الإرسال الفائق: إرسال ما يصل إلى 4 أهداف لكل تفاعل.
- أداء رائد في السوق: حساسية وخصوصية وقابلية تكرار وكفاءة فائقة مقارنة بالتركيبات الرائدة في الصناعة الحالية.
- إنتاجية موثوقة: مثالية للبيئات ذات الإنتاجية العالية حيث تكون سهولة الاستخدام والتوافق مع أنظمة التشغيل الآلي ودقة النتائج أمورًا بالغة الأهمية.
- مدعوم بالجودة: تضمن جودة QIAGEN الاتساق من دفعة إلى أخرى، مما يقلل من التباين بين الاختبارات ويزيد من صحة البيانات.

- يقلل من النسخ العكسي غير المحدد والزائف أثناء إعداد التفاعل في درجة حرارة الغرفة.
- يحافظ على أداء قوي للفحص بعد فترة حضانة مسبقة مطولة (تصل إلى 24 ساعة) في درجة حرارة الغرفة.
- يمنع فقدان الكشف أو انخفاض السعة الناتج عن الحضانة المسبقة في درجة حرارة الغرفة.

- درجة حرارة التخزين: من -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية

مزيج ZipScript One-Step RT-qPCR هو مزيج من إنزيم النسخ العكسي EnzScript وإنزيم بوليميراز الحمض النووي Taq ذو التشغيل الساخن Phoenix. يُعد EnzScript بوليميرازًا قويًا للحمض النووي يعتمد على الحمض النووي الريبي (RNA) ولا يحتوي على أي نشاط RNase H قابل للكشف. يمكن استخدام هذا الإنزيم لإنتاج الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبي الرسول (mRNA) أو الحمض النووي الريبي الكلي ضمن نطاق درجة حرارة مثالي يتراوح بين 42 و50 درجة مئوية.

إن بوليميراز فينيكس هو بوليميراز Taq DNA مُعاد التركيب، مُقاوم للحرارة، مُرتبط بجسم مضاد مُعادل غير مُستقر حراريًا. تُعزز هذه الخاصية، التي تعتمد على بدء التفاعل الساخن بوساطة الجسم المضاد سريع التنشيط، الخصوصية والحساسية والإنتاجية الإجمالية لتفاعل PCR عن طريق تقليل التضخيم غير النوعي وتكوين ثنائيات البادئات قبل بدء دورات التفاعل. بالاشتراك مع EnzScript، يُنتج فينيكس ZipScript، وهو مزيج RT-qPCR فائق الحساسية يتميز بما يلي:

يقلل إنزيم النسخ العكسي ذو البدء الدافئ والمُعتمد على الأبتامر، والموجود في مزيج ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR بتركيز 10X، من النسخ العكسي غير النوعي أثناء تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة، ويُحسّن من دقة وفعالية التحليل. كما تُسهّل إضافة خاصية WarmX حلول الأتمتة عالية الإنتاجية.

ZipScript WarmX:

خصائص الخلطة

مبدأ

مزيج ZipScript One-Step RT-qPCR هو مزيج من إنزيمات النسخ العكسي EnzScript و Phoenix Hot Start Taq DNA Polymerase.

تقوم إنزيمات النسخ العكسي ببلمرة سلسلة من الحمض النووي (cDNA) تُكمل قالب الحمض النووي الريبوزي (RNA) الأصلي. ويمكن بعد ذلك تضخيم الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتحليل النسخ والتعبير الجيني. يمتلك إنزيم النسخ العكسي الفيروسي الأصلي ثلاث وظائف كيميائية حيوية متسلسلة: نشاط بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبوزي، ونشاط إنزيم الريبونيوكلياز H (RNase H)، ونشاط بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي. تُمكّن هذه الوظائف مجتمعةً الإنزيم من تحويل الحمض النووي الريبوزي أحادي السلسلة إلى حمض نووي تكميلي ثنائي السلسلة. يعمل نشاط إنزيم الريبونيوكلياز H على تحليل سلسلة الحمض النووي الريبوزي في هجين الحمض النووي/الحمض النووي الريبوزي، مما يُحرر سلسلة الحمض النووي المُصنّعة حديثًا لاستخدامها كقالب في تخليق السلسلة الثانية من الحمض النووي. يُعتبر نشاط إنزيم الريبونيوكلياز H غير مُجدٍ لتخليق سلاسل الحمض النووي التكميلي الطويلة، نظرًا لاحتمالية قيام الإنزيم بتحليل قالب الحمض النووي الريبوزي قبل اكتمال عملية النسخ العكسي الكاملة.

لا يمتلك إنزيم النسخ العكسي EnzScript أي نشاط ملحوظ لإنزيم RNase H، ويتميز بثبات حراري عالٍ. يُعد هذا الإنزيم مناسبًا لإنتاج الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) متعدد الأدينين (poly(A)) أو الحمض النووي الريبوزي الكلي (RNA) لاستخدامه في تطبيقات لاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، واستنساخ الحمض النووي التكميلي، أو بناء مكتبات الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq).

إن إنزيم فينيكس هوت ستارت تاك دي إن إيه بوليميراز هو إنزيم تاك دي إن إيه بوليميراز مُعاد التركيب، مقاوم للحرارة، مُرتبط بجسم مضاد مُعادل مقاوم للحرارة، يعمل على منع نشاط البوليميراز 5ʹ→3ʹ قبل خطوة تمسخ الحمض النووي الأولية في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تُعزز هذه الخاصية، التي تعتمد على الجسم المضاد، بدء التفاعل الساخن، مما يُحسّن من الخصوصية والحساسية والإنتاجية الإجمالية لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عن طريق تقليل التضخيم غير النوعي وتكوين ثنائيات البادئات قبل دورات تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، كما يُتيح سهولة تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة.

لتحسين دقة وفعالية التحليل، خاصةً في الحلول الآلية عالية الإنتاجية، تتميز مجموعة ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR بإنزيم RTase ذي بدء تشغيل دافئ قائم على الأبتامر، والذي يمنع النسخ العكسي أثناء تحضير التفاعل في درجة حرارة الغرفة. يضمن إجراء بدء التشغيل الدافئ/الساخن ثنائي المراحل أداءً قويًا للتفاعل، مما يسمح بتحضير تفاعلات مكثفة في درجة حرارة الغرفة بثقة تامة.

إجراء

المكونات: الحجم لكل تفاعل
ماء خالٍ من النيوكلياز: حتى يصل حجم التفاعل النهائي إلى 20 ميكرولتر
2x محلول التفاعل ZipScript I: 10 ميكرولتر
50x ROX (اختياري): 0.4 ميكرولتر
مزيج البادئ والمسبار: X ميكرولتر
مزيج إنزيمات ZipScript بتركيز 25x: 0.8 ميكرولتر
قالب الحمض النووي الريبوزي: متغير

الخطوات: درجة الحرارة
النسخ العكسي: 50 درجة مئوية
تنشيط إنزيم Taq والتفكك الأولي: 95 درجة مئوية
التمسخ: 95 درجة مئوية
التلدين والتمديد*: 60 درجة مئوية

المكونات: الحجم لكل تفاعل
ماء خالٍ من النيوكلياز: حتى يصل حجم التفاعل النهائي إلى 20 ميكرولتر
محلول التفاعل ZipScript I بتركيز 2X: 10 ميكرولتر
مزيج البادئ والمسبار: X ميكرولتر
مزيج إنزيمات ZipScript WarmX بتركيز 10X: 2 ميكرولتر
قالب الحمض النووي الريبوزي: حتى 2 ميكرولتر

الخطوات: درجة الحرارة (°م)
النسخ العكسي: 50
تنشيط Taq والتمسخ الأولي: 95
درجة التمسخ: 95
التلدين والتمدد*: 60

- يجب حفظ جميع المكونات وإعدادات التفاعل على الجليد.
- قم بإذابة عبوتيّ ZipScript Reaction Buffer I بالكامل، ثم قم برجّهما لمدة 3-5 ثوانٍ لخلطهما جيداً. قم بتدويرهما بسرعة لجمع المحتويات إذا لزم الأمر.
- حضّر مزيج البادئات والمجسات. يُوصى بتركيز نهائي يتراوح بين 0.4 و0.9 ميكرومولار لكل بادئ، وبين 0.1 و0.5 ميكرومولار للمجس. مع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل للبادئات والمجسات تجريبيًا لكل اختبار.
- حدد عدد التفاعلات المراد تحضيرها، بما في ذلك عينات التحكم بدون قالب (NTCs). أضف 10% حجمًا إضافيًا لتعويض الفاقد أثناء النقل بالماصة.
استخدم الكميات المذكورة في الجدول أدناه لتحضير مزيج التفاعل. نوصي بتحضير مزيج رئيسي لتقليل التباينات والأخطاء المحتملة. المكونات: الحجم لكل تفاعل، التركيز النهائي: ماء خالٍ من النيوكلياز، حتى حجم تفاعل نهائي 20 ميكرولتر - محلول تفاعل ZipScript I بتركيز 2x، 10 ميكرولتر، 50x ROX (اختياري)، 0.4 ميكرولتر، مزيج البادئ والمسبار بتركيز 1x، X ميكرولتر، متغير، مزيج إنزيم ZipScript بتركيز 25x، 0.8 ميكرولتر، قالب RNA بتركيز 1x، متغير، متغير.
- أغلق صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وقم بتدويرها لفترة وجيزة لترسيب الكواشف.
- اضبط ظروف التفاعل وفقًا للتوصيات أدناه. الخطوات درجة الحرارة الوقت الدورات النسخ العكسي 50 درجة مئوية 15 دقيقة 1 تنشيط Taq والتفكك الأولي 95 درجة مئوية دقيقتان 1 التفكك 95 درجة مئوية 15 ثانية 40 التلدين والاستطالة* 60 درجة مئوية 30-60 ثانية * يمكن تعديل معايير التفاعل (خاصة معايير التلدين والاستطالة) لتناسب اختيار البادئات والمجسات المحددة. إعداد تفاعل ZipScript WarmX One-Step RT-qPCR

إعداد تفاعل RT-qPCR بخطوة واحدة من ZipScript

1. قم بإذابة عبوة محلول التفاعل ZipScript 2X تمامًا، ثم قم برجها لمدة 3-5 ثوانٍ لخلطها جيدًا. قم بتدويرها سريعًا لجمع المحتويات إذا لزم الأمر.

٢. تحضير مزيج البادئات والمجسات. يُوصى بتركيز نهائي يتراوح بين ٠.٤ و٠.٩ ميكرومولار لكل بادئ، وبين ٠.١ و٠.٥ ميكرومولار للمجس. مع ذلك، يجب تحديد التركيز الأمثل للبادئات والمجسات تجريبيًا لكل اختبار.

3. حدد عدد التفاعلات المطلوب تحضيرها، بما في ذلك عينات التحكم بدون قالب (NTCs). أضف 10% حجمًا إضافيًا لتعويض الفاقد أثناء السحب بالماصة.

٤. استخدم الكميات المذكورة في الجدول أدناه لتحضير مزيج التفاعل. نوصي بتحضير مزيج رئيسي لتقليل الاختلافات والأخطاء المحتملة.

5. أغلق صفيحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وقم بتدويرها لفترة وجيزة لإنزال الكواشف.

6. قم ببرمجة ظروف ركوب الدراجات بناءً على التوصيات الواردة أدناه.

* يمكن تعديل معلمات التدوير (خاصة معلمات التلدين والتمديد) لتناسب اختيار البادئ والمسبار المحدد.

تحليل مراقبة الجودة

يتم تقييم فعالية برنامج ZipScript من خلال تضخيم ثلاثة نسخ mRNA في اختبار RT-qPCR أحادي الخطوة. تتم مقارنة عتبة التضخيم (Cq) للدفعة المختبرة مع دفعة مرجعية.

يتم تقييم فعالية جهاز ZipScript WarmX من خلال تضخيم ثلاثة نسخ mRNA في اختبار RT-qPCR أحادي الخطوة. تتم مقارنة عتبة التضخيم (Cq) للدفعة المختبرة مع دفعة مرجعية.

تم اختبار وظيفة آلية بدء التشغيل الدافئ لخاصية بدء التشغيل الدافئ في ZipScript WarmX عن طريق تضخيم نسخة mRNA باستخدام تقنية RT-qPCR المعتمدة على SYBR بعد حضانة مسبقة للتفاعل لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. وأكد تحليل منحنى الذوبان عدم وجود تضخيم غير نوعي.

تم اختبار مكونات الإنزيم قبل تحضير المزيج الرئيسي، وثبت خلوها من أي ملوثات من الإنزيمات الداخلية والخارجية. بلغت نقاوة الإنزيم أكثر من 99% وفقًا لتحليل SDS-PAGE، وتم تأكيد وجود تلوث ضئيل جدًا بالحمض النووي الجينومي لبكتيريا الإشريكية القولونية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). تم التحقق من النشاط النوعي لكل تركيبة إنزيمية قبل تحضيرها.

التطبيقات

- تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي بخطوة واحدة
- تحليل التعبير الجيني لأهداف الحمض النووي الريبي
- الكشف عن الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA وتحديد كميتهما
يُعد برنامج ZipScript WarmX مثاليًا لتطبيقات RT-qPCR أحادية الخطوة مع حلول أتمتة عالية الإنتاجية

هذا المنتج متوفر لتطبيقات البيولوجيا الجزيئية مثل: